Здесь можно найти учебные материалы, которые помогут вам в написании курсовых работ, дипломов, контрольных работ и рефератов. Так же вы мажете самостоятельно повысить уникальность своей работы для прохождения проверки на плагиат всего за несколько минут.

ЛИЧНЫЙ КАБИНЕТ 

 

Здравствуйте гость!

 

Логин:

Пароль:

 

Запомнить

 

 

Забыли пароль? Регистрация

Повышение уникальности

Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp», которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение уникальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения уникальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии и при повышении уникальности не вставляет в текст скрытых символов, и даже если препод скопирует текст в блокнот – не увидит ни каких отличий от текста в Word файле.

Результат поиска


Наименование:


курсовая работа Пластический метаболизм прокариот: биосинтез пуринов и пиримидинов. Репликация ДНК и РНК

Информация:

Тип работы: курсовая работа. Добавлен: 04.06.13. Сдан: 2013. Страниц: 34. Уникальность по antiplagiat.ru: < 30%

Описание (план):




Министерство образования  и науки Украины
Национальный технический  университет Украины «КПИ»
 
 
Факультет биотехнологии  и биотехники
Кафедра промышленной биотехнологии
 
 
 
 
Курсовая работа
с курса «Общая микробиология  и вирусология»
на тему “ Пластический метаболизм прокариот: биосинтез пуринов и пиримидинов. Репликация ДНК и РНК”
 
 
 
Руководитель:                                                            Выполнила:  
доц., к.б.н. Орябинская Л.Б.                                     студентка 2-го курса,
                                                                                     ФБТ
Допушена к защите:                                                  группы БЕ-81
“     ”                     2010 г                                             Девяткина Л.В.
Защищено с оценкой:                                                Зачетная книжка:
                                                                                     № БЕ-8102
 
 
 
 
 
Киев 2010
СОДЕРЖАНИЕ
 
ВВЕДЕНИЕ                                                                                                        3
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ                                                                                     5
1. Предшественники нуклеиновых кислот. Биосинтез пуринов и пиримидинов                                                                                                      5
1.1. Основные компоненты нуклеиновых  кислот                                           5
1.2. Синтез пуринов                                                                                           9
1.3. Синтез пиримидинов                                                                                 13
1.4. Образование дезоксирибонуклеотидов                                                   17
2. Дезоксирибонуклеиновая кислота                                                              19
2.1. Структура ДНК                                                                                         19
2.2. Физические свойства ДНК прокариот                                                    26
2.3. Формы ДНК в клетках прокариот                                                            29
2.4. Репликация                                                                                                34
2.5. Различия в ДНК прокариот и эукариот                                                  41
3. Рибонуклеиновая кислота                                                                           42
3.1. Виды РНК и их  структурная организация                                             43
3.2. Транскрипция                                                                                             46
3.3. Различия в РНК  прокариот и эукариот                                                  51
ВЫВОДЫ                                                                                                          53
ЛИТЕРАТУРА                                                                                                  54
 
 
 
 
 
 
 
 
ВВЕДЕНИЕ
 
Один из классиков, пусть сильно упрощенно, но определял жизнь как способ существования белковых тел. Действительно, макромолекулы, не только белкового происхождения, являются обязательным компонентом жи-вотных и растений, микроорганизмов и даже существ, стоящих на грани жи-вого – вирусов и фагов.
Как известно, основная функция ДНК – это хранение генетической ин-формации, которая заложена в структуре молекулы. РНК, в свою очередь, принимает участие в передачи этой информации потомкам. Таким образом, генетическая связь между организмами существует именно благодаря нукле-иновым кислотам.
В наше время ученые проявляют  все больший интерес к структурно-функциональной организации генов и, следовательно, нуклеиновых кислот, а также к  биосинтезу этих макромолекул,  у  различных организмов. Данные, полученные современными учеными все более широко используются в судебной медицине и криминалистике. В последние годы четко наметилась тенденция к использованию обычных либо модифицированных олигонуклео-тидных блоков в качестве лекарственных препаратов, диагностических средств, всевозможных наноструктур. В настояшее время развивается ряд других направлений исследований молекул нуклеиновых кислот, включая молекулярную археологию, молекулярную палеонтологию и ДНК-компью-тинг, бывших ранее в своих классических вариантах весьма далёкими от био-логии.
Изучение механизмов передачи генов у бактерий и участие  в этом про-цессе внехромосомных элементов открыло возможность включения чужерод-ной ДНК в бактериальные клетки. Генетические манипуляции позволяют вносить небольшие отрезки носителей генетической информации высших организмов, например человека, в бактерию, заставляя её синтезировать необходимые вещества, и наоборот. Вполне осуществимо производство гор-монов, антител, антигенов и других белков с помощью бактерий. Делаются также попытки передать растениям способность к азотфиксации и лечить болезни, связанные с биохимическими дефектами. Всё это, безусловно, ОТК-рывает новые горизонты в генной инжинерии.
Целью данной работы является изучение структуры и функций  нуклеи-новых кислот и их предшественников,  ознакомление с ключевыми этапами биосинтеза этих макромолекул, а также с ферментами, участвующими в дан-ных процессах.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. ПРЕДШЕСТВЕННИКИ НУКЛЕИНОВЫХ  КИСЛОТ. СИНТЕЗ ПУРИНОВ И ПИРИМИДИНОВ
 
1.1. Основные компоненты нуклеиновых кислот
Нуклеиновые кислоты  представляют собой высокомолекулярные линейные гетерополимеры с молекулярной массой от 250 до 1,2 • 105kDa. Мономерными звеньями нуклеиновых кислот являются нуклеотиды. Мононуклеотиды при нагревании до 145 0 С с водным раствором аммиака теряют остаток фосфорной кислоты с образованием нуклеозидов. Нуклеозиды в условиях кислотного гидролиза распадаются на азотистые основания и сахара. Таким образом, при полном гидролизе нуклеиновых кислот образуются азотистые основания, моносахарид пентоза (рибоза или дезоксирибоза) и фосфорная кислота. В составе ДНК открыт также кремний в количестве 0,26—0,31%, поэтому предполагают, что он в нуклеиновых кислотах изоформен фосфору и способен включаться в полинуклеотидную последовательность [8].
Углеводными компонентами служат две пентозы: D-рибоза и 2-дезокси-D-рибоза. Отсюда нуклеиновые кислоты делятся на рибонуклеи-новые, содержащие рибозу (РНК) и дезоксирибонуклеиновые, содержа-щие дезоксирибозу (ДНК). Фуранозное кольцо рибозы и дезоксирибозы может принимать целый ряд конформаций типа “конверта” и других неплоских “скошенных” конформаций. Обычно либо атом С-2’, либо атом С-3’ выходят из плоскости других четырех атомов кольца. Если этот атом углерода расположен выше кольца, т. е. находится от него со стороны основания, то конформацию называют эндо, если же он лежит ниже кольца, то получается экзо-конформация. Свободные нуклеотиды нахо-дятся преимущественно в С(2’)-эндо- и С(3’)-эндо-конформациях, однако в В-форме ДНК, по всей вероятности, реализуется конформация С(3’)-экзо. Скошенные конформации типа С(2’)-эндо – С(3’)-экзо и конформа-ции конверта легко переходят одна в другую.[11]
Нуклеиновое основание – гетероциклическое соединение пуринового или пиримидинового рядов. В качестве заместителей в гетероциклическом ядре они содержат либо оксо- (урацил, тимин), либо аминогруппу (аде-нин), либо одновременно обе (цитозин, гуанин) (рис. 1.1.1)
                                   
                    
                                  
Рисунок 1.1.1 - Азотистые основания
 
Известно, что гидрокси- и аминопроизводные гетероциклического ря-да способны к лактим-лактамной и амино-иминной таутомерии соответст-венно. Однако, при физиологических условиях нуклеиновые основания существуют только в лактамной и аминной формах. В лактамных таутоме-рах гетероциклы сохраняют ароматичность и имеют плоское строение. Ароматичность гетероциклов лежит в основе их относительно высокой термодинамической стабильности.
Нуклеиновые кислоты также различаются  входящими в них гетеро-циклическими основаниями: урацил входит только в РНК, а тимин – в ДНК. Кроме выше приведенных нуклеиновых оснований, называемых ос-новными, в небольших количествах встречаются и другие азотистые осно-вы (минорные). К ним относятся гипоксантин, 5-метил-цитозин, 1-N-ме-тилгуанин, дигидроурацил и др. В ДНК некоторых бактериофагов вместо цитозина имеются 5-гидроксиметилцитозин. [18]
Гетероциклическое основание соединяется  с пентозой и образует нуклеозид. В нуклеозиде гликозидный атом пентозы С-1 связан с N-1 пи-римидинового или N-9 атомом пуринового основания (N-гликозидная связь). Во всех нуклеозидах, встречающихся в живых клетках, эта глико-зидная связь находится в ?-конфигурации (рис. 1.1.2.).[15]
                                           
Рисунок 1.1.2 – Общая  структура нуклеозида
 
Являясь N-гликозидами, нуклеозиды устойчивы к гидролизу в слабо-щелочной среде, но расщепляются в кислой. Пуриновые нуклеозиды гид-ролизуются легко, пиримидиновые  труднее.
Нуклеозиды сокращенно обозначают однобуквенным кодом (сущест-вует также система трехбуквенного кода). В однобуквенном сокращении используется начальная буква их названия с добавлением префикса d в случае дезоксинуклеотидов, например дезоксиаденозин обозначается dA.
Нуклеозиды в клетке в основном связаны друг с другом по средствам фосфодиэфирных связей и образуют полинуклеотидные цепи. Но нуклео-зиды могут находиться и в свободном состоянии. Эти нуклеозиды облада-ют антибиотической активностью и приобретают все большее значение в лечении злокачественных образований. Известны несколько десятков та-ких нуклеозидов, выделенных из микроорганизмов, а также растительных и животных тканей.
Нуклеозиды-антибиотики  отличаются от обычных нуклеозидов  неко-торыми деталями строения либо углеродной части, либо гетероцикличес-кого основания. Это позволяет им выступать, по видимому, в роли анти-метаболитов. Нуклеозидные антибиотики пиримидинового ряда подобны цистидину, а пуринового – аденозину. Например, выделенный из грибни-цы Cordyceps militaries антибиотик кордицепин отличается от аденозина только отсутствием в углеродном остатке 3’-OH-группы. Сильными анти-биотическими свойствами обладает пуромицин,  выделенный из культу-ральной жидкости  Streptomyces alboniger. Он является ингибитором рибо-сомального синтеза белка. Выраженным действием на вирус СПИДа, сни-жающим его размножение, обладает азидотимидин (рис. 1.1.3).
Некоторые микроорганизмы выделяют вещества нуклеозидной при-роды, в состав которых вместо рибозы входит его эпимер по С-2 – ?-D-арабиноза. Например, сильными антивирусными и антигрибковыми свой-ствами обладают арабинозилциозин и арабинозиладенин (рис. 1.1.3).

Рисунок 1.1.3. - Нуклеозиды-антибиотики
 
Таким образом, имеющаяся небольшая разница в строении или кон-формации одного атома углерода (С-2) в углеродном остатке достаточно, чтобы соединение выполняло роль ингтбитора биосинтеза ДНК. Это слу-жит основой для создания новых лекарственных средств методом молеку-лярной модификации природных моделей.
Фосфорный эфир нуклеозида называют нуклеотидом. Фосфорная кислота обычно эстерифицирует спиртовый гидроксил при С-5 атоме са-хара. Такое соединение называется нуклеозид-5’-фосфатом. Цифрами со штрихом отмечаются атомы пентозы, цифрами без штриха – атомы пури-нового или пиримидинового кольца. Нуклеотид, образующийся при эте-рификации 5’-гидроксильной группы аденозина, - это аденозин-моно-фосфат. Аденозинтрифосфат (АТФ) – универсальная форма запаса энер-гии в клетке.[18]
 
 
1.2 Синтез пуринов
Пуриновое кольцо нуклеотидов  собирается из различных предшест-венников. Глицин дает атомы С-4, С-5, и N-7. Атом N-1 происходит из ас-партата. Еще два атома азота, N-3 и N-9, происходят из амидогруппы бо-ковой цепи глутамина. Активированные производные тетрагидрофолята поставляют С-2 и С-8, тогда как СО2 служит источником С-6 (рис. 1.2.1).

Рисунок 1.2.1. – Источники  атомов углерода и азота для синтеза  пуринового кольца
 
Путь биосинтеза пуринов  был расшифрован в 50-х годах  в работах Джона Бьюкенена, Дж. Роберта Гринберга и др. Рибофосфатный  остаток пуриновых нуклеотидов  произходит из 5-фосфорибозил-1-пирофосфата (ФРПФ). ФРПФ синтезируется из АТФ и рибозо-5’-фосфата, который в свою очередь образуется в реакциях пентозофосфатного пути. Пирофос-фатная группа переносится с АТФ на С-1 рибозо-5-фосфата. ФРПФ нахо-дится в ?-конфигурации.
Дальше происходит образование 5-фосфорибозиламина из ФРПФ и глутамина. Аминогруппа боковой цепи глутамина замещает пирофосфат-ную группу, и ?-конфигурация переходит в ?-конфигурацию. Движущая сила этой реакции – гидролиз пирофосфата. Продукт присоединения гли-цина к фосфорибозиламину – рибонуклеотид глицинамида. На образова-ние амидной связи между карбоксильной группой глицина и аминогруп-пой фосфорибозиламина затрачивается одна молекула АТФ. Затем ?-ами-ногруппа остатка глицина формилируется N5,N10–метинилтетрагид-рофолята, образуя рибонуклеотид ?-N-формилглицинамида. Амидная группа этого соединения превращается в амидиновую группу. Атом азота происходит из боковой цепи глутамина; в этой реакции затрачивается одна молекула АТФ. Рибонуклеотид формилглицинамидина вступает в реакцию замыкания кольца с образованием рибонуклеотида 5-амино-имидазола. Этот промежуточный продукт содержит полное пятичленное кольцо пуринового остова. На этом заканчивается первый этап синтеза пу-риновых нуклеотидов.
Теперь начинается второй этап синтеза скелета пурина – образование шестичленного кольце. Три из шести атомов этого кольца уже присутст-вуют в рибонуклеотиде аминоимидозола. Три другие атома приходят из СО2, аспартата и N5,N10метинилтетрагидрофолята. Следуйщий атом уг-лерода шестичленного кольца вводится путем карбоксилирования рибо-нуклеотида аминоимидазола, приводящим к образованию рибонуклеотида 5-аминоимидазол-4-карбоновой кислоты. Затем аминогруппа аспартата реагирует с карбоксильной группой этого продукта с образованием рибо-нуклеотида 5-аминоимидазол-4-N-сукцинокарбоксамида. На образование этой амидной связи затрачивается молекула АТФ. В следуйщей реакции углеродный скелет аспартата отщепляется в виде фумарата, и образуется рибонуклеотид 5-аминоимидазол-4-карбоксамида. Следует отметить, что в результате этих двух реакций карбоксилат превращается в амид. Таким образом из аспартата в пуриновое кольцо включается только атом азота. Последний атом пуринового кольца происходит из N5,N10–метинилтетра-гидрофолята. В результате образуется рибонуклеотид 5-формилимидазол-4-карбоксиламид; он претерпевает дегидротацию и замыкание кольца, давая инозинат (ИМФ), содержащий полный пуриновый скелет. Пуриновое основание, входяшее в состав инозината, называется гипок-сантин. Схема синтеза пуриновых нуклеотидов представлена на рисунке 1.2.2.


Рисунок 1.2.2 – Схема  синтеза пуринов [14]
 
Инозинмонофосфат является предшественником аденин- и гуанинмо-нофосфатов. Аденилат синтезируется из инозината путем введения амии-ногруппы по С-6 положению вместо карбонильного кислорода. Амино-группу поставляет аспартат путем присоединения этой аминокислоты к рибонуклеотиду и последующего удаления фумарата. ГТФ - донор высо-коэнергетической фосфатной связи при синтезе аденилосукцината из ино-зита и аспартата.
Гуанилат (гуанинмонофосфат) синтезируется путем окисления ино-зината и последующего введения аминогруппы в положение С-2. НАД+ - акцептор водорода при окислении инозината до ксантилата. Затем амино-группа боковой цепи глутамина переносится на ксантилат. В этой реакции тратятся две высокоэнергетические связи, так как АТФ расщепляется на АМФ и ФФ(н), который затем гидролизуется.
Пуриновые основания  могут использоваться повторно с помощью реакций синтеза из готовых остатков с участием ФРПФ. Свободные пури-новые основания образуются путем гидролитического расщепления нук-леиновых кислот и нуклеотидов. Пуриновые нуклеотиды могут синтези-роваться из таких предобразованных оснований с помощью реакций син-теза из готовых остатков. Эти реакции проще чем пути синтеза de novo, и обходятся клетке гораздо дешевле. При синтезе из готовых остатков рибо-зофосфатная группа ФРПФ переносится на пурин и образуется соответ-ствующий нуклеотид – это альтернативный путь синтеза пуриновых нуклеотидов.
Существуют два фермента, участвующие в реакциях синтеза из го-товых остатков, имеющие разную специфичность. Аденинфосфо-рибозил-трансфераза катализирует образование аденилата:
Аденин + ФРПФ > Аденилат + ФФ(н)
Гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза катализирует образо-вание инозината и гуанилата:
Гипоксантин + ФРПФ >  Инозинат + ФФ(н)
Гуанин + ФРПФ > Гуанилат + ФФ(н)  [15]
Ключевой стадией биосинтеза пуринов является образование 5-фос-форибозиламина. Катализирующий эту реакцию фермент глутамин-фос-форибозилпирофосфат—амидотрансфераза ингибируется моно-, ди- и трифосфатами гуанозина и аденозина, что замедляет соответствующие ре-акции основного пути биосинтеза. Так как смесь адениновых и гуани-новых производных ингибирует гораздо сильнее, чем отдельные соедине-ния, то было предположено, что у фермента имеются отдельные участки связывания для адениновых и гуаниновых ингибиторов.
 ГMФ ингибирует образование ХМФ, а AMФ ингибирует синтез аде-нилосукцината из ИMФ. В результате, этот механизм обратной связи пре-дотвращает дальнейшее образование AMФ или ГMФ, когда какой-либо из них присутствует в избыточном количестве. Некоторые регуляторные ста-дии синтеза пуриновых нуклеотидов показаны на рис.1.2.3. [20]

Рисунок 1.2.3 – Регуляция  синтеза пуриновых нуклеотидов
 
1.3. Синтез пиримидинов
В отличие от последовательности реакций синтеза пуриннуклеотидов de novo пиримидиновое кольцо вначале собирается и только затем присо-единяется к рибозофосфату с образованием пиримидиннуклеотида. Доно-ром рибозофосфата при синтезе пиримидиннуклеотидов, так же как и при синтезе пуриннуклеотидов, служит ФРПФ. Предшественники пиримиди-нового кольца - карбамоилфосфат и аспартат (С-2 и N-3 происходят из карбамоилфосфата, остальные атомы кольца - из аспартата) (рис. 1.3.1)

Рисунок 1.3.1 – Источники  атомов углерода и азота для синтеза  пиримидинового кольца
 
Синтез пиримидинов  начинается с образования карбамоилфосфата, который служит также промежуточным продуктом синтеза мочевины. Решающий этап в биосинтезе пиримидинов - образование N-карбамоила-спартата из аспартата и карбамоилфосфата. Карбамоилирование катали-зируется аспартит-транс-карбамоилазой (аспартат-карбамоил-трансфера-зой, АТКазой), ферментом, особенно интересным с точки зрения регуляции. Пиримидиновое кольцо образуется в следующей реакции, когда кар-бамоиласпартат циклизуется с отщеплением молекулы воды и образо-ванием дигидрооротата. Затем при дегидратации дигидрооротата образу-ется оротат.
Следующий этап синтеза  пиримидиннуклеотидов - присоединение рибозофосфатной группы. Оротат (свободный пиримидин) реагирует с ФРПФ с образованием оротидилата (пиримидиннуклеотид). Протекание этой реакции, которую катализирует оротидилат-пирофосфорилаза, поддерживается гидролизом пирофосфата. Затем оротидилат декарбоксилиру-ется, образуя уридилат (уридинмонофосфат, УМФ) - главный пиримидин-нуклеотид. Схема синтеза пиримидиновых нуклеотидов представлена на рисунке 1.3.2 .[15]

Рисунок 1.3.2 – Схема  синтеза пиримидинов
 
 Фактическими предшественниками для синтеза нуклеиновых кислот служат нуклеозидтрифосфаты, которые образуются из нуклеотид моно-фосфатов (НМФ). Таким образом, образование УТФ из УМФ происходит в результате последовательных трансферазных (киназных) реакций при действии нуклеозидмонофосфат- и нуклеозиддифосфаттрансфераз:
УМФ    +     АТФ     -     УДФ   +   АДФ
УДФ   +   АТФ   -    УТФ   +    АДФ [8].
УМФ далее может использоваться для синтеза других пиримидино-вых мононуклестидов — ЦМФ и dTМФ. Образование ЦМФ протекает через ряд последовательных стадий:
УМФ + АТФ  >  УТФ + АМФ
УТФ + глутамин + АТФ  >  ЦТФ + глутамат + АДФ + Н3PO4
ЦТФ + АМФ  >  ЦМФ + АТФ
Как и синтез пуринов, синтез пиримидинов находится под  метабо-лическим контролем, основанным на ингибурующем действии конечных продуктов по типу обратной связи. Регуляторными ферментами являются карбомаилфосфатсинтетаза, аллостерическим ингибитором которой явля-ется УТФ, и аспартаткарбрмаилтрансфераза, которая ингубируется ЦТФ (рис. 1.3.3).

Рисунок 1.3.3 – Регуляция  синтеза пиримидинов
 
Следует отметить, что тип и специфичность контроля обнаруживают интересные вариации в зависимости от вида: аспартаткарбомаилтрансфе-разы из Е.coli, Aerobacter aerogenes и Serratia marcescens ингибируются по принципу обратной связи в присутствии ЦТФ, тогда как фермент из Pseudomonas fluorescens сильнее всего реагирует на УТФ. Далее аспартат-карбомаилтрансфераза из Bacillus subtilis, по-видимому, не ингибируется по аллостерическому типу, а репрессируется её синтез по принципу обрат-ной связи. Эти данные, безусловно, свидетельствуют о многообразии и видовой специфичности регуляторных механизмов клетки, определяющих скорость биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов.
Аналогично пуриновым нуклеотидам  пиримидиновые нуклеотиды также могут образовываться из свободных пиримидинов или нуклеозидов по запасным метаболическим путям. Урацил (и 5-фторурацил) могут быть превращены в УМФ и 5-F-УМФ прямой реакцией с ФРПФ, катализи-руемой урацил-фосфорибозилтрансферазой, которая имеется в клетках как животных, так и микробов. Цитозин не является субстратом  для этого фермента.
урацил   +   ФРПФ   -  уридин-5'-фосфат   +   ФФн
УМФ может образовываться также из уридина с помощью уриди-цитидинкиназы:
                                                 Mg2+
уридин  +  АТФ     >   уридин-5-фосфат   +   АДФ
В этой реакции субстратами могут служить уридин, цитидин и соответствующие фторпроизводные, но не оротидин. Наконец, уридин мо-жет синтезироваться из урацила с помощью реакции, катализируемой ури-динфосфорилазой, которая в обратном направлении приводит к фосфоро-лизу уридина.
урацил   +   рибозо-1-фосфат   -   уридин   +   Фн
Фосфоролитическое расщепление  цитидина неизвестно; однако после дезаминирования цитидиндезаминазой образовавшийся уридин является субстратом для фосфорилазы.
1.4. Образование дезоксирибонуклеотидов
Пуриновые и пиримидиновые  дезоксирибонуклеотиды образуются в результате восстановления рибозного остатка соответствующего рибонук-леотида. Превращение рибозы в дезоксирибозу идет без расщепления свя-зи рибозы с пиримидином.
Механизм этого превращения был выяснен сначала при изучении восстановления рибонуклеотидов в экстрактах Е. coli. Один фермент — рибонуклеозид-дифосфат-редуктаза — катализирует восстановление всех четырех рибонуклеозиддифосфатов AДФ, ГДФ, ЦДФ и УДФ в их дезокси-производные dAДФ, dГДФ, dЦДФ и dУДФ соответственно. Механизм восстановления включает атаку гидрид-ионом Н- по атому С-2' рибозного остатка, что приводит к замещению гидроксильной группы у С-2’ на атом водорода без изменения конфигурации.
Источник восстанавливающей  способности рибонуклеозид-редуктазы in vivo неизвестен. Однако было показано, что in vitro активны два донора водорода. Одним является маленький серосодержащий белок тиоредок-син, вторым - восстановленный глутатион, который работает в присутст-вии нового белка — глутаредоксина.
dУМФ, непосредственный предшественник dТМФ, образуется при гидролизе УТФ, катализируемом дезоксиуридинтрифосфатдифосфогидро-лазой (dУТФазой):
дезоксиуридин-5'-трифосфат + Н20 > дезоксиуридин-5'-фосфат + ФФн
Эта реакция служит также для предотвращения включения урацила в ДНК (рис. 1.3.4).

Рисунок 1.3.4 – Общая  схема взаимопревращений пиримидиновых  дезоксирибонуклеотидов
 
Активность рибонуклеозид-дифосфат-редуктазы  аллостерически ре-гулируется нуклеозидтрифосфатами, одни из них работают как стиму-ляторы, другие - как ингибиторы. Так, восстановление ЦДФ и УДФ силь-но стимулируется АТФ, а восстановление AДФ и ГДФ стимулируют dГТФ и dTTФ. dATФ ингибирует восстановление всех четырех рибонук-леозиддифосфатов. В присутствии Са2+, Мg2+ или Мn2+ dЦТФ является аллостерическим активатором этого фермента, а dТТФ — ингибитором. Метилирование dУМФ катализируется тимидилатсинтетазой.
Общая система эффекторов и ингибиторов делает возможным  сбалан-сированное поступление восстановленных дифосфатов и, следовательно, трифосфатов, непосредственных предшественников синтеза ДНК. [20]
 
2. ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВАЯ  КИСЛОТА 
 
Вся информация о признаках, присущих организму, сосредоточена в его генетическом аппарате. Он обеспечивает сохранение и воспроизве-дение этих признаков в процессе размножения организма, так как возник-ающие дочерние особи обнаруживают в большинстве случаев полное сходство с родительскими формами. Это говорит о том, что генетический аппарат обладает высокой стабильностью и точностью механизмов, обес-печивающих его функционирование. Однако стабильность генетического аппарата не абсолютна, так как это исключало бы всякую возможность его изменений и, следовательно, эволюционных преобразований, приведших в конечном итоге к возникновению разнообразных форм жизни, свидете-лями (и представителями) которых мы являемся. Таким образом, генети-ческий аппарат должен быть организован так, чтобы, с одной стороны, обеспечивать свою стабильность, с другой — быть достаточно пластич-ным, т. е. обладать способностью к изменчивости.
2.1. Структура ДНК
 Генетический материал  любой клетки представлен ДНК, информа-ционные свойства которой определяются специфической последователь-ностью четырех нуклеотидов в полинуклеотидной цепи. Эта последова-тельность и является первичной структурой ДНК [3] .
Как было сказано выше, в состав ДНК входят такие азотистые основания как аденин, гуанин, цитозин и тимин, а также специфические минорные (мо-дифицированные) основания. Такие минорные основания нужны для того чтобы отличить собственную ДНК от чужеродной, так как чужеродная ДНК может стать губительной для клетки хозяина. Преобразование стандартного основания на минорное происходит с помощью специальных модифициру-ющих ферментов. Практически все виды бактерий имеют метилазы, модифи-цирующие аденин или цитозин в определенной, характерной для данного вида последовательности ДНК. Другой специальный фермент, эндонуклеаза рестрикции (рестриктаза), узнает ту же последовательность и разрезает ее, если она не модифицирована, т. е. попала в клетку извне. Таким путем бакте-рии ограничивают возможности попадания в них постороннего генетическо-го материала. Некоторые ферменты рестрикции представлены в таблице 2.1.1
Таблица 2.1.1 – Ферменты рестрикции
Фермент рестрикции
Сайт узнавания 
Источник
 Bst I
5’ – GGATC*C – 3’
      CC*TAGG
Bacillus stearothermophilus
Hind III
5’ – A*AGCTT – 3’
      TTCGAA*
Haerophilus influenzae Rd
Alu I
  5’ – AGC*T – 3’
        TC*GA
Arthrobacter luteus
Pst I
5’ – CTGCA*G – 3’
      GA*CGTC   
Providencia stuartii

 
 
Последовательно расположенные  нуклеотиды в молекулах ДНК и РНК ковалентно связаны друг с другом при помощи фосфатных «мос-тиков». 5'-гидроксильная группа пентозы одного нуклеотида присоеди-нена к З'-гидроксильной группе пентозы соседнего нуклеотида с помощью фосфодиэфирной связи (рис.2.1.1). Таким образом, ковалентные остовы нуклеиновых кислот состоят из монотонно чередующихся фосфат-ных и пентозных групп; основания же можно рассматривать как боковые групп-пы, присоединенные к остову на равных расстояниях друг от друга. Структуру одиночной цепи ДНК изображают всегда так, что слева располагается 5'-конец, а справа -  З'-конец, т.е. в направлении 5'> 3'.

Рисунок 2.1.1 – Первичная  структура ДНК
 
Межнуклеотидные связи  в ДНК и РНК можно химически расщепить с помощью гидролиза. Их можно гидролизовать и ферментами, которые называются нуклеазами. Некоторые нуклеазы способны расщеплять связи между двумя соседними нуклеотидами, расположенными внутри цепи, такие нуклеазы называют эндонуклеазами. Нуклеазы другого класса могут катализировать гидролиз только связи концевого нуклеотида или у 5'- или у 3'-конца молекулы; эти ферменты относятся к экзонуклеазам.
В конце 40-х годов Эрвином Чаргаффом  и его коллегами из Колум-бийского университета велась работа по изучению структуры ДНК. Они обнаружили, что четыре основания встречаются в ДНК разных организ-мов в различных соотношениях и что между основаниями существует оп-ределенная количественная связь. На основе этого были сделаны следую-щие выводы:
1. Нуклеотидный состав ДНК у разных видов различен.
2. Число адениновых остатков в любой ДНК независимо от вида организма равно числу тиминовых остатков (А = Т), а число гуаниновых остатков всегда равно числу цитозиновых остатков (Г = Ц). Из этих соот-ношений следует, что сумма пуриновых остатков равна сумме пиримиди-новых остатков, т.е. А + Г = Т + Ц.
3. В ДНК отношение Г + Ц/А + Т, называемое коэффициентом специфичности, близко к единице. [9]
В ДНК некоторых видов  преобладает суммарное количество аденина и тимина, это так называемые АТ-тип ДНК. ГЦ-тип (с суммарным преоб-ладанием гуанина и цитозина) встречается у микроорганизмов, хотя некоторые из них могут иметь и АТ-тип. Нуклеотидный состав ДНК бак-терий в настоящее время используют как один из таксономических при-знаков. Состав ДНК различных бактерий представлен в приложении А.
Результаты рентгеноструктурного анализа ДНК, опубликованные Вилкинсом, Франклином, свидетельствуют о том, что нуклеотиды ДНК расположены в форме спирали (рис 2.1.2) с периодом идентичности (ша-гом) 3,4 нм и расстоянием между плоскостями оснований 0,34 нм. На основании этих данных, Уотсон и Крик предложили модель вторичной структуры ДНК, в которой две цепи, состоящие из нуклеотидов, соеди-ненных 3',5'-фосфодиэфирными мостиками, сплетены друг с другом, так что на каждый виток спирали приходится 10 пар оснований. Диаметр спирали 2,0 нм. [20]
Также было установлено, что двойная спираль ДНК может существовать в виде нескольких форм (А, В, С, Z и др.). Указанные формы ДНК различа-ются диаметром и шагом спирали, числом пар оснований в витке, углом наклона плоскости оснований по отношению к оси молекулы. [1]
Гидрофобные пуриновые и пиримидиновые основания обеих цепей уложены стопкой внутри двойной спирали, так что практически плоские молекулы оснований сближены между собой и расположены перпен-дикулярно длинной оси двойной спирали. Пространственное взаиморас-положение цепей приводит к возникновению большой и малой бороздок.

Рисунок 2.1.2 – Двойная спираль  ДНК
 
Основания одной цепи спарены с находящимися в той же плоскости основаниями другой цепи. Внутри этой структуры точно пригнанными оказываются только определенные пары оснований. Такими соответству-ющими друг другу парами всегда являются пары пурин-пиримидин, а именно пары А - Т и Г – Ц. Более того, основания каждой пары настолько сближены, что между ними возникают водородные связи. Такие основа-ния называются комплементарными. Как образуются водородные связи между комплементарными основаниями, показано на рис.2.1.3 .

Рисунок 2.1.3 – Водородные связи в комплементарных основаниях [7]
 
 Комплементарность цепей составляет химическую основу важней-шей функции  ДНК — хранения   и   передачи наследственных признаков. Сохранность нуклеотидной последовательности является залогом безоши-бочной передачи генетической информации. Однако нуклеотидная после-довательность ДНК может подвергаться  мутациями.
Наиболее распространенный вид  мутации — замена какой-либо пары оснований на другую. Одной из причин замены может явиться сдвиг таутомерного равновесия. Например, тимин в лактамной форме не обра-зует водородные связи с гуанином, а в лактимной форме образует, что приводит к замене обычной пары тимин — аденин на пару тимин — гуанин.
Замена «нормальных» пар оснований передается при транскрипции ДНК и приводит в итоге к изменению аминокислотной последовательнос-ти в синтезируемом белке. [18]
Помимо формирования спиральных участков вторичной структуры, нуклеиновые  кислоты способны и к образованию специфической прост-ранственной конфигурации, т.е. третичной структуры. Детальная ин-формация о третичной структуре ДНК пока отсутствует, хотя предпо-лагают, что в ней могут образовываться изломы с нарушением спаривания двух соседних пар оснований и небольшим раскручиванием остова. Повторяясь, через каждые 10 пар оснований такие изломы способны порождать левую сверхспираль с диаметром около 10 нм, каждое звено которой состоит из 10 пар оснований, так что на каждые 140 пар оснований приходится приблизительно 1.5 витка.
Другой тип изломов приводит к образованию правой сверхспирали, содержащей 9.6 пар оснований на виток. Однако в клетке ДНК обычно находится  в постоянном контакте с белками, образуя различные ДНК-белковые комплексы, для формирования которых существенной оказыва-ется вторичная структура ДНК. Образование петель и сверхспиральность помогают обеспечить упаковку очень больших кольцевых молекул ДНК в малых объемах, не ограниченных мембранами. [10]
 В клетках прокариот ДНК подвергается циклизации с образованием кольцевой структуры (рис. 2.1.4). Эта кольцевая молекула подвергается суперспирализации, после чего прикрепляется к особым участкам клеточной мембраны. При сверхспирализации создается впечатление, что двойная спираль прежде, чем концы ее цепей соединились в кольцо, была частично раскручена. Это обратное скручивание сообщает кольцевой молекуле ДНК вращающий момент, вследствие чего она закручивается сама на себя. Если такую сверхспиральную ДНК, в которой запасена дополнительная энергия, подвергнуть действию эндонуклеазы, разрывающей одну из цепей, то скрученность, вызванная обратным вращением, снимается и ДНК переходит в свое обычное низкоэнергетическое релак-сированное состояние.

Рисунок 2.1.4 – Сверхспиральная  и релаксированная кольцевая ДНК
 
Сверхспиральность играет важную роль во многих процессах, происходящих с участием ДНК. Некоторые белки и ферменты не связы-ваются с ДНК, если она находится не в сверхспиральной форме. Фер-менты, называемые топоизомеразами, могут регулировать степень сверх-спиральности, увеличивая или уменьшая число сверхвитков. [9]
Важная характеристика замкнутой  кольцевой ДНК - ее порядок зацепления L. Число L указывает, сколько раз одна цепь пересекает дру-гую цепь, если их спроецировать на плоскость. Число L должно быть це-лым. Кручение Т и величина суперспирализации связаны между собой уравнением
L = W + Т,
т.е. находятся в обратной зависимости. Порядок зацепления – топологи-ческая характеристика; она может изменяться, лишь когда в одну или в обе цепи кольцевой ДНК вносятся разрывы. Действительно, были выде-лены ферменты, которые каталитически изменяют величину L. Каталити-ческую активность таких топоизомераз легко выявить с помощью гель-эл-ектрофореза, так как суперспирализованная ДНК имеет большую подвиж-ность, чем релаксированная ДНК. [16]
2.2. Физические свойства ДНК прокариот
Основными физическими  характеристиками ДНК являются раство-римость, вязкость, отношение к действию температура, рН, УФ-излуче-ния, а также оптические свойства  молекулы. Рассмотрим подробнее эти характеристики. 
Раствоимость. Нуклеиновые кислоты в водных растворах всегда сильно отрицательно заряжены, так как сахарофосфатный остов ДНК и РНК имеет отрицательный заряд фосфатных групп, которые депротони-рованы при характерных для клеток значениях рН.
Молекулу нуклеиновой кислоты невозможно представить себе в чис-том виде, поскольку являясь полиэлектролитами, они нуждаются в про-тивоионах. Кроме того, всегда наблюдается сильное связывание молекул обычных растворителей (например, воды) с биополимерами. Поэтому ре-альным объектом в водном растворе всегда является гидратированная мо-лекула, несущая противоионы. Степень взаимодействия нуклеиновых кис-лот с водой не позволяет считать их растворы идеальными ни при каких концентрациях.
Дейстиве УФ-излучения. Все нуклеиновые кислоты сильно погло-щают свет в УФ-области с максимумом ~260 нм. Когда нативность ДНК нарушается, наблюдается заметный гиперхромный эффект — увеличение поглощения. Это изменение отражает уменьшение числа водородных связей. Действие УФ-излучения на организм может привести к мутациям. Частым типом структурных повреждений ДНК, вызываемых УФ-излуче-нием, является образование пиримидиновых димеров в результате кова-лентного связывания соседних пиримидиновых оснований. Реже УФ вы-зывает разрыв водородных связей, образование межцепочечных попереч-ных сшивок.
Оптическое  вращение. Нативная ДНК обладает сильным положительным вращением плоскости поляризации света, которое заметно уменьшается при денатурации.
Вязкость. Растворы нативной ДНК имеют высокую вязкость. Разрушение водородных связей приводит к заметному уменьшению вязкости.
Влияние температуры. Нагревание образца ДНК в определенной ионной среде вызывает увеличение поглощения в УФ-области и снижение оптического вращения и вязкости, отражая разрушение водородных свя-зей между нитями двойной спирали.
Поскольку взаимодействия между основаниями двух цепей  коопера-тивны, подобно взаимодействиям между молекулами в кристалле, упоря-доченная спиральная структура разрушается в пределах небольшого тем-пературного интервала, как это происходит при плавлении кристалла. По этой причине денатурацию двухцепочечной ДНК при нагревании часто называют «плавлением» ДНК, а температуру, при которой денатуриро-вано 50% ДНК,— температурой плавления Тпл.
Препараты ДНК из разных источников имеют различные Тпл, которые зависят от абсолютных количеств Г + С и А + Т. Чем выше содержание Г+С, тем выше температура перехода между нативной двойной спиралью   и  одноцепочечной  формой. Определение значений Тпл при использова-нии для калибровки препаратов ДНК с известным составом позволяет вычислить содержание Г+C и A+T неизвестной ДНК. Такое определение следует проводить при фиксированной ионной силе и рН, так как эти факторы существенно влияют на стабильность ДНК.
Влияние рН. В достаточно широкой области рН характеристическая вязкость ДНК сохраняет неизменное значение. Тем не мение в областях рН<4,5 и рН>8,5 гидродинамические свойства ДНК сильно меняются (рис.2.2.1).

Рисунок 2.2.1 – Зависимость  характерической вязкости от рН для  растворов ДНК при различных ионных силах (М: 1 - 0,006; 2 - 0,023; 3 - 0,1).
 
В области кислых рН наблюдается  резкое уменьшение характеристи-ческой вязкости, свидетельствующее о компактизации молекулы ДНК. Параллельно происходит некоторое уменьшение коэфицента молекуляр-ной экстинкции. Подробное исследование зависимости коэффициента экс-тинкции от рН среды показало, что по крайней мере до рН = 3,5. ДНК сох-раняет двуспиральную структуру, и наблюдаемый конформационный переход, фиксируемый по изменению характеристической вязкости, не яв-ляется результатом денатурации ДНК. Денатурация ДНК происходит при более низких значениях рН.
В области щелочных рН наблюдается возрастание характеристичес-кой вязкости ДНК с последующим её падением. При это могут изменяться как объемные эффекты, так и персистентная длинна полимеров. [2]
Действие химических реагентов. При контакте с положительно заряженными молекулами происходит внедрение катионов между стоп-ками пар оснований за счёт взаимодействия квазиароматических элект-ронных облаков азотистых оснований с вакантными орбиталями катионов; в результате наблюдается раскручивание (интеркаляция) двойной спирали или суперспирали. Кроме того, такие соединения, как амиды (формамид, мочевина), увеличивая сольватацию ароматических ядер азотистых осно-ваний молекулами воды, также способствуют разрыву водородных связей между основаниями.
Описанные выше нарушения  вторичной структуры ДНК за счет разрыва водородных связей получили название денатурации. Денатурация  нуклеиновых кислот может быть обратимым процессом; скорость ренату-рации тем больше, чем меньше степень денатурации. Например, при пол-ной денатурации ДНК нагреванием две комлементарные нити ренатури-руют очень медленно (происходит так называемый "отжиг ДНК”) и только при медленном охлаждении раствора ДНК. При быстром охлажде-нии степень ренатурации невелика. 
2.3. Формы ДНК в клетках прокариот
Как уже говорилось  ДНК является первичным носителем  наследст-венной информации у всех живых организмов. Эта информация заклю-чается в генетическом аппарате (геноме) организма. Под понятием генома у бактерий обычно подразумевается хромосома, образующая в бактерии-альной клетке особую органеллу — нуклеоид. Помимо хромосомы в генофонд, которым фактически располагает клетка, входит и внехромо-сомная ДНК. [17]
Нуклеоид достаточно четко выявляется в световом микроскопе после специфической  окраски на ДНК по методу Фёльгена или при окраске флу-орохромами. Его можно наблюдать и с помощью фазово-контрастного устройства у крупных бактерий или сине-зеленых водорослей, как темное и более контрастное образование в срединной части клетки. На ультра-тонких срезах зона нуклеоида представлена тонкими рыхлыми сетями фибрилл толщиной 2-7 нм. Эта зона нуклеоида или нуклеоплазмы на ульт-ратонких срезах свободна от других структур и выглядит более светлой по сравнению с окружающей цитоплазмой, заполненной рибосомами, раз-личными гранулами и мембранами. Иногда на срезах можно наблюдать контакты фибрилл нуклеоида с плазматической мембраной, с ее выроста-ми.
Нуклеоиды бактерий можно выделить, их состав и структура изучены довольно подробно, они на 80% состоят из ДНК, кроме которой обнару-живаются различные белки (20%) и РНК. [22]
Внехромосомная ДНК представлена плазмидами, инсерционными фрагментами (IS-фрагментами), транспозонами. Для плазмид характер-но стабильное существование в нехромосомном состоянии. Транспозоны и IS-элементы входят, как правило, в состав хромосом, но способны пере-ходить из хромосомы в плазмиду, поэтому также могут быть отнесены к нехромосомным генетическим элементам.
Изучение нехромосомных  генетических элементов обнаружило, что общий объем ДНК, входящий в их состав, превышает объем генома каждой особи. Таким образом, у прокариот большой объем генетической информации оказывается рассредоточенным в нехромосомных элементах. Это заставляет по-новому подходить к вопросу об организации генети-ческой информации в мире прокариот. Особенностью генетической ин-формации, содержащейся в нехромосомных элементах, является ее необя-зательность для жизнедеятельности бактерий, т. е. в ее отсутствие бакте-риальная клетка жизнеспособна, новажная роль нехромосомных генети-ческих элементов заключается в том, что они расширяют возможности су-ществования бактериального вида, обеспечивают обмен генетическим ма-териалом на большие расстояния по горизонтали и играют определенную роль в эволюции прокариот.
Плазмиды обнаружены у многих бактерий, принадлежащих к разным таксономическим группам. Количество плазмидной ДНК в клетке состав-ляет обычно не более нескольких процентов от клеточного генома, а чис-ло плазмид колеблется от 1 до 38. Плазмиды — это линейные или коль-цевые ковалентно замкнутые молекулы ДНК, содержащие от 1500 до 40000 пар нуклеотидов. Большинство плазмид состоит из трех групп ге-нов: участка ДНК, ответственного за автономную репликацию плазмиды в клетке; системы генов, обеспечивающих возможность переноса плазмид из одной клетки в другую; генов, определяющих свойства, полезные для клетки-хозяина.
Иногда плазмиды могут  встраиваться в главную молекулу ДНК и на-ходиться в ней, как ее часть, подобно любой другой последовательности. Встроенные плазмиды называют эписомами. Эписома может также вы-щепляться из главной молекулы ДНК и опять становиться свободной плазмидой.
Обычно о присутствии  плазмид в бактериальной клетке судят по про-явлению определенных признаков, к которым относится устойчивость к отдельным лекарственным препаратам, способность к переносу генов при конъюгации, синтез веществ антибиотической природы, способность ис-пользовать некоторые сахара или обеспечивать деградацию ряда веществ. Из перечисленного выше видно, что плазмиды делают возможным сущес-твование организмов в более широком диапазоне условий внешней среды, т.е. действуют как факторы адаптации. [3]
В соответствии с определёнными  признаками, кодируемыми плаз-мидными генами, выделяют следующие группы плазмид:
• F-плазмиды. При изучении процесса скрещивания бактерий оказалось, что способность клетки быть донором генетического материала связана с присутствием особого F-фактора. F-плазмиды контролируют синтез F-пи-лей.
• R-плазмиды кодируют устойчивость к лекарственным препаратам (на-пример, к антибиотикам и сульфаниламидам, хотя некоторые детерминанты устойчивости правильнее рассматривать как связанные с транспо-зонами), а также к тяжёлым металлам. R-плазмиды включают все гены, ответственные за перенос факторов устойчивости из клетки в клетку.
Неконъюгативные плазмиды обычно характерны для грамположи-тельных кокков, но встречаются также у некоторых грамотрицательных микробов (например, у Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae). Они обычно имеют небольшие размеры. Обнаруживают большое количество мелких плазмид (более 30 на клетку), так как только наличие такого коли-чества обеспечивает их распределение в потомстве при клеточном деле-нии. При конъюгации донор может передать и неконъюгативные плазми-ды за счёт связывания генетического материала последних с конъюгатив-ной плазмидой.
Плазмиды биодеградации. Обнаружен также ряд плазмид, кодиру-ющих ферменты деградации природных (мочевина, углеводы) и непри-родных (толуол, камфора, нафталин) соединений, необходимых для ис-пользования в качестве источников углерода или энергии, что обеспечива-ет им селективные преимущества перед другими бактериями данного ви-да. Патогенным бактериям подобные плазмиды придают преимущества перед представителями аутомикрофлоры.
Вставочные (инсерционные) последовательности — простейший тип мигрирующих элементов (рис. 2.3.1, А); их величина не превышает 1500 пар оснований (в среднем 800-1400). IS-элементы самостоятельно не реплицируются и не кодируют распознаваемых фенотипических приз-наков. Содержащиеся в них гены обеспечивают только их перемещение из одного участка в другой. Основные функции IS-последовательностей — регуляция активности генов бактериальной клетки (могут инактивировать гены, в которые включились, или, встраиваясь в хромосому, проявлять эф-фект промотора, включающего либо выключающего транскрипцию соот-ветствующих генов), координация взаимодействий ппазмид, траспозонов и профагов (как между собой, так и бактериальной хромосомой).

Рисунок 2.3.1 – Инсерционная последовательность (А), транспозон (Б)
 
Транспозоны состоят из 2000-25000 пар нуклеотидов, содержат фраг-мент ДНК, несущий специфические гены, и два концевых IS-элемента (рис. 2.3.1, Б). Транспозоны не способны к самостоятельной репликации и размножаются только в составе бактериальной хромосомы. Каждый тран-спозон обычно содержит гены, привносящие важные для бактерии харак-теристики типа множественной устойчивости к антибактериальным аген-там. Поскольку транспозоны содержат гены, определяющие фенотипичес-ки выраженные признаки (например, устойчивость к антибиотикам), то их легче обнаружить, чем IS-элементы. В общем, для транспозонов характер-ны те же гены, что и для плазмид (гены устойчивости к антибиотикам, токсинообразования, дополнительных ферментов метаболизма). [13]
2.4. Репликация ДНК
Способность генетического  материала, ДНК, к самовоспроизведению (репликации) лежит в основе размножения живых организмов, передачи наследственных свойств из поколения в поколение.
 Модель ДНК Уотсона  и Крика сразу же позволила понять принцип удвоения ДНК. Поскольку каждая из цепей ДНК содержит последователь-ность нуклеотидов, комплементарную другой цепи, т. е. их информацион-ное содержание идентично, представлялось вполне логичным, что при удвоении ДНК цепи расходятся, а затем каждая цепь служит матрицей, на которой выстраивается комплементарная ей новая цепь ДНК. В резуль-тате образуются два дуплекса ДНК, каждый из которых состоит из одной цепи исходной родительской молекулы ДНК и одной новосинтезиро-ванной цепи. Экспериментально показано, что именно так, по полуконсер-вативному механизму, происходит репликация ДНК. Несмотря на просто-ту основного принципа, процесс репликации сложно организован и тре-бует участия множества белков. Эти белки, как и все другие, закодирова-ны в последовательности нуклеотидов ДНК. Таким образом, возникает важнейшая для жизни петля обратной связи: ДНК направляет синтез бел-ков, которые реплицируют ДНК.
Комплементарное копирование  матрицы осуществляют ферменты ДНК-полимеразы. Первый фермент этого типа был открыт в 1956 г. у Е. coli, затем ДНК-полимеразы были обнаружены в других организмах. ДНК-полимеразы ведут синтез ДНК на одноцепочечной матрице, если имеется затравка — комплементарный матрице фрагмент растущей цепи ДНК. ДНК-полимеразы последовательно наращивают конец затравки, шаг за шагом присоединяя к нему следующие нуклеотиды, причем выбор очередного нуклеотида для присоединения к концу затравки диктуется матрицей.
Субстрат для ДНК-полимеразы,   поступает в реакцию в активиро-ванной высокоэнергетической форме дезоксирибонуклеозидтрифосфата. Присоединение очередного нуклеотида к концу затравки сопровождается гидролизом богатой энергией связи и отщеплением пирофосфата, что и делает реакцию в целом энергетически выгодной. Наличие в клетке пиро-фосфатазы обеспечивает расщепление пирофосфата и делает реакцию практически необратимой. При полимеризации растет всегда 3'-конец затравки, т. е. синтез происходит в направлении 5'>3': 3'-ОН-группа кон-цевого нуклеотида затравки атакует фосфат очередного дезоксирибонук-леозидтрифосфата (но только в том случае, если он комплементарен очередному нуклеотиду матрицы), в результате чего отщепляется пирофос-фат, а дезоксирибонуклеозидмонофосфат оказывается связанным фосфо-диэфирной связью с растущей цепью ДНК, удлиняя ее на одно звено.
Затравка антипараллельна матрице (рис. 2.4.1). Естественно, эта по-лярность сохраняется и при ее дальнейшем росте, так что результатом ра-боты ДНК-полимеразы на одноцепочечной матрице является антипарал-лельная двойная спираль ДНК.

Рисунок 2.4.1 – Матричный синтез ДНК
 
 Необходимая для полимеризации геометрия химических группировок в активном центре ДНК-полимераз задается с помощью координа-ционного взаимодействия определенных атомов матрицы, затравки и суб-страта с ионами металлов. Субстраты поступают в реакцию синтеза ДНК в виде комплексов (хелатов) с ионами Мg2+. Ионы обеспечивают правильную взаимную ориентацию 3'-ОН-группы затравки, фосфата субстрата и очередного нуклеотида матрицы. Показано, что ионы цинка способны и без ферментов в ограниченной степени катализировать образование комплементарных матрице олигонуклеотидов из активированных субст-ратов.
Нормальное размножение  клеток требует высокой точности копирования ДНК-матрицы. У всех организмов точность работы репликатив-ной машины (включающей не только ДНК-полимеразы, но и другие белки) как раз такова, чтобы обеспечить безошибочное воспроизведение всего генома или допустить лишь малое число ошибок. Так, у бактерий ошибки синтеза ДНК происходят не чаще чем один раз на много мили-онов нуклеотидов. Для того чтобы обеспечить высокую точность наряду с высокой скоростью репликации, природе пришлось прибегнуть к специ-альным механизмам, один из которых — механизм коррекции.
ДНК-полимеразы проверяют комплементарность каждого нуклеотида матрицы дважды: один раз перед включением его в состав растущей цепи и второй раз перед тем, как включить следующий нуклеотид. Очередная фосфодиэфирная связь образуется лишь в том случае, если последний (3'-концевой) нуклеотид затравки комплементарен матрице. Если же на пре-дыдущей стадии полимеризации произошла ошибка (например, из-за того, что нуклеотид в момент полимеризации находился в необычной тауто-мерной форме), то репликация останавливается до тех пор, пока непра-вильный нуклеотид не будет удален. Некоторые ДНК-полимеразы обла-дают не только полимеризующей, но и 3'-экзонуклеазной активностью, которая отщепляет не спаренный с матрицей нуклеотид затравки, после чего полимеризация восстанавливается. Этот механизм, коррекция, замет-но увеличивает точность работы ДНК-полимераз.
Иногда один полипептид обладает и полимеразной, и 3'-экзонук-леазной активностями, в других случаях за эти активности ответственны разные субъединицы мультисубъединичного фермента. У некоторых ДНК-полимераз корректирующая экзонуклеазная активность не обнару-жена.
Репликация лучше всего  изучена у Е. coli. У этого организма есть три ДНК-полимеразы (I, II и III). Все три фермента и их аналоги из других бактерий обладают корректирующей способностью.
ДНК-полимераза I состоит из одного полипептида длиной 911 аминокислотных остатков (а. а.) (Мг=102 000 Д). Этот фермент отличается от прочих ДНК-полимераз Е. coli наличием 5'-экзонуклеазной активности. Фактически ДНК-полимераза I — это два фермента на одной полипептид-ной цепи: ограниченный протеолиз расщепляет эту ДНК-полимеразу на большой и малый фрагменты с разными активностями. Большой субфраг-мент ДНК-полимеразы I (называемый также ДНК-полимеразой Кленова или фрагментом Кленова) обладает полимеризующей и 3'-экзонуклеазной (корректирующей) активностями. Малый субфрагмент несет 5'-экзонукле-азную активность. 5'-экзонуклеаза ДНК-полимеразы I действует на 5'-ко-нец полинуклеотидной цепи только в составе дуплекса и отщепляет от него как моно-, так и олигонуклеотиды. Направление действия 5'-экзонук-леазы совпадает с направлением полимеризации новой цепи ДНК, т. е. в ходе полимеризации экзонуклеаза «расчищает дорогу» для полимеразы. Подобные свойства ДНК-полимеразы I соответствуют ее функциям в клетке: эта полимераза удаляет различного рода дефекты из ДНК в ходе репарации и служит вспомогательной полимеразой при репликации ДНК, удаляя РНК-затравки. В клетке Е. coli имеется несколько сотен молекул ДНК-полимеразы I.
ДНК-полимераза II — полипептид с Мг около 120000, обладающий полимеразной и 3'-экзонуклеазной активностями. Эта полимераза лучше всего работает на двуцепочечной ДНК с одноцепочечными брешами в не-сколько десятков нуклеотидов длиной. На этом основании можно предпо-ложить, что ДНК-полимераза II участвует в репарации ДНК. Главную роль в репликации ДНК у Е. coli играет большой мультисубъединичный фермент — ДНК-полимераза III. В клетке всего несколько таких мульти-меров, приблизительно столько же, сколько репликативных вилок. ДНК-полимераза III состоит из 7 типов субъединиц (таблица 2.4.1) и имеет суммарную молекулярную массу около 500 кД.
 
Таблица 2.4.1 – Компоненты холофермента ДНК-полимеразы III E.coli

 
Отличительная черта  холофермента ДНК-полимеразы III — исключительно высокая процессивность синтеза ДНК (количество нуклеотидов, присоединяемых ферментом к растущей цепи между двумя последовательными актами диссоциации с матрицы).
ДНК-полимеразы не способны инициировать новые цепи ДНК. Они могут лишь достраивать уже имеющуюся затравку. Это свойство, по-ви-димому, связано с предъявляемым к синтезу ДНК требованием высокой точности. Новосинтезированные цепи ДНК всегда содержат на 5'-конце несколько рибонуклеотидов. Иными словами, синтез ДНК начинается с синтеза РНК. РНК-затравку для синтеза ДНК образует специальный фер-мент, называемый ДНК-праймазой. После того как цепь ДНК начала син-тезироваться, РНК-затравки удаляются и образовавшиеся бреши застраи-ваются ДНК-полимеразой, т. е. с высокой точностью.
Нативные ДНК двуспиральны; следовательно, перед репликацией  це-пи родительской молекулы, матричные цепи ДНК, должны быть разделе-ны. Эту реакцию осуществляют два типа белков: хеликазы и SSB-белки. Хеликазами называют ДНК-зависимые АТФ-азы, использующие энергию гидролиза АТФ для расплетания двойной спирали ДНК. Считается, что хеликаза, движимая гидролизом АТФ, однонаправленно «едет» по одной из цепей ДНК, расплетая перед собой двойную спираль. Есть хеликазы, которые едут от 5'-конца к 3'-концу цепи ДНК, и есть другие, перемеща-ющиеся в обратном направлении. В результате работы хеликаз возникает «вилка» из двуспирального участка ДНК и двух одноцепочечных ветвей. Ренатурации одноцепочечных участков ДНК препятствует их связывание SSB-белком, имеющим избирательное сродство к однонитевой ДНК (рис. 2.4.2). Роль SSB-белка в репликации, по-видимому, состоит в том, чтобы расправить ДНК, вытянуть ее и удалить возможные элементы вторичной структуры, которые могли бы образоваться в самокомплементарных учас-тках ДНК. Связывание одноцепочечной ДНК с SSB-белком стимулирует ДНК-полимеразу и повышает точность ее работы. SSB-белок Е. coli — тетрамер, состоящий из идентичных субъединиц размером 19 кД. SSB-белок связывается с ДНК кооперативно, т. е. за счет белок-белковых взаи-модействий тетрамеры покрывают ДНК вплотную друг к другу. [1]

Рисунок 2.4.2 – Расплетение  двойной спирали ДНК хеликазой  и SSB-белком
 
Так как цепи ДНК в дуплексе антипараллельны, то очевидно, что на-правление расплетания двойной спирали при репликации совпадает с на-правлением синтеза ДНК лишь для одной матричной цепи, но противопо-ложно направлению синтеза ДНК на комплементарной матрице. Это зна-чит, что лишь на одной из матричных цепей синтез ДНК может проис-ходить непрерывно. Показано, что ДНК синтезируется сравнительно ко-роткими фрагментами, называемыми фрагментами Оказаки. Таким обра-зом, синтез ДНК на двух матричных цепях исходной молекулы заметно различается. Новосинтезированная цепь, которая синтезируется непрерыв-но, называется ведущей, другая цепь называется запаздывающей. Каждый фрагмент оказаки имеет на 5'-конце несколько рибонук-леотидов — ре-зультат действия праймазы. Фрагменты сшиваются в одну ковалентноне-прерывную цепь ДНК предназначенным специально для этого ферментом, ДНК-лигазой.
ДНК-лигазы обнаружены у  самых разных организмов. Они нуждаются в высокоэнергетических кофакторах: например, лигаза Е. coli нуж-дается в NAD+, а широко используемая для генно-инженерных методик лигаза фага Т4 — в АТФ. Прежде чем образовать фосфодиэфирную связь, соединяющую два фрагмента ДНК, лигаза активирует 5'-конец одного из фрагментов с помощью высокоэнергетического кофактора 3. [9]
2.5. Различия в ДНК прокариот и эукариот
Геном бактерий практически  целиком состоит из генов (с их индиви-дуальной последовательностью оснований) и примыкающих к ним регуля-торных элементов. Почти все природные ДНК состоят из двух цепей (иск-лючение составляют одноцепочечные ДНК некоторых вирусов). При этом ДНК может иметь линейную форму (ДНК эукариот) или кольцевую (ДНК прокариот). У эукариот кольцевая ДНК может входить в состав митохон-дрий и хлоропластов. ДНК этих органелл называют цитоплазматической; она составляет примерно 0,1% всей клеточной ДНК.
 В клетках прокариот ДНК организована в одну хромосому (нукле-оид) и представлена одной кольцевой макромолекулой. Нуклеоид, в отли-чии от ядра эукариот, не отделен от цитоплазмы ядерной мембраной, в нем может содержаться несколько копий ДНК. Плотность генов в геноме прокариот значительно выше, чем в геноме эукариот. В отличие от боль-шинства эукариотических генов гены прокариот не прерываются некоди-руюшими областями, т.е. не имеют мозаичной экзон-интронной струк-туры.
Кроме того, в клетках  некоторых бактерий имеется одна или не-сколько плазмид. У эукариот основная масса ДНК находится в ядре клет-ки в составе хромосом (ядерная ДНК). В каждой хромосоме эукариот име-ется только одна линейная молекула ДНК, но так как во всех клетках эука-риот (кроме половых) присутствует двойной набор гомологичных хромо-сом, то и ДНК представлена двумя неидентичными копиями, получен-ными организмом от отца и матери при слиянии половых клеток.
Молекулярная масса  эукариотических ДНК выше, чем  у ДНК прокариот. Размеры молекул ДНК обычно выражаются числом образу-ющих их нуклеотидов. Эти размеры варьирует от нескольких тысяч пар нуклеотидов у бактериальных плазмид и некоторых вирусов до многих сотен тысяч пар нуклеотидов у высших организмов. [21]
Таким образом ясно, что  наследственная информация записана в ли-нейной последовательности нуклеотидов. У разных организмов она строго индивидуальна и служит важнейшей характеристикой, отличающей одну молекулу ДНК от другой и, соответственно, один ген от другого. Организ-мы разных видов отличаются друг от друга потому, что молекулы ДНК их клеток имеют разную последовательность нуклеотидов, то есть несут разную информацию.
 
3. РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА
 
Молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК) представлены в различных внутриклеточных отсеках, более широко чем ДНК. Они имеют значительно меньшую молекулярную массу. Первичная структура, подобно ДНК, пред-ставлена последовательностью нуклеотидов, однако, азотистое основание ти-мин в РНК заменяет урацил. Состав РНК различных бактерий представлен в приложении А таблице 2. Молекулы РНК, построенные из двух комплемен-тарных полинуклеотидных цепей, встречаются редко и обнаруживаются только в составе некоторых вирусов.
Количественное содержание РНК в клетке значительно варьирует  по мере роста культуры и составляет 86,8 • 10-15
и т.д.................


Перейти к полному тексту работы


Скачать работу с онлайн повышением уникальности до 90% по antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru


Смотреть полный текст работы бесплатно


Смотреть похожие работы


* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.