На бирже курсовых и дипломных проектов можно найти образцы готовых работ или получить помощь в написании уникальных курсовых работ, дипломов, лабораторных работ, контрольных работ, диссертаций, рефератов. Так же вы мажете самостоятельно повысить уникальность своей работы для прохождения проверки на плагиат всего за несколько минут.

ЛИЧНЫЙ КАБИНЕТ 

 

Здравствуйте гость!

 

Логин:

Пароль:

 

Запомнить

 

 

Забыли пароль? Регистрация

Повышение уникальности

Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp», которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение уникальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения уникальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии и при повышении уникальности не вставляет в текст скрытых символов, и даже если препод скопирует текст в блокнот – не увидит ни каких отличий от текста в Word файле.

Результат поиска


Наименование:


реферат Генотерапия раковых заболеваний

Информация:

Тип работы: реферат. Добавлен: 12.06.13. Сдан: 2013. Страниц: 25. Уникальность по antiplagiat.ru: < 30%

Описание (план):


I. Реверсия ракового фенотипа.
    Замена мутантной аллели гена на нормальную копию.
 
Впервые попытка  генной терапии в клинике была предпринята М.Клайном в 1983 году., когда им было осуществлено введения нормального бета-глобинового гена больным бета-талассемией. Позднее была разработана методика генной терапии наследственной недостаточности аденозин-деаминазы (тяжелый иммунодефицит): нормальный ген был введен в клетки костного мозга больного и после их ретрансплантации восстановилась активность фермента, состояние больного улучшилось. Проведены клинические эксперименты по генотерапии рака. В лейкоциты больных злокачественной меланомой и поздними стадиями рака были введены гены, маркирующие злокачественные клетки (чтобы их могла узнавать имунная система). У половины больных размеры опухолей уменьшились в два раза и более.
- клетки  остеосаркомы имели мутации в гене Rb1; введение кДНК нормального гена Rb1 в эти клетки в культуре вызывало их реверсию;
- в раковые  клетки также в культуре вводился  нормальный ген wt53; под его  действием раковые клетки теряли  свойства ракового фенотипа. Из  работы не ясно, насколько стабильна  реверсия раковых клеток в  этих опытах.
 
    Перенос в раковые клетки нормальной аллели гена в случае мутации с потерей функции.

    Подавление экспрессии мутантной аллели гена в случае доминантно-негативной мутации.
3.1) Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов.
 
Антисмысловая РНК— получаемый искусственно или природный полирибонуклеотид, комплементарный определенной мРНК и подавляющий ее биологическую активность за счет образования с ней дуплекса, что препятствует трансляции мРНК на рибосомах. Природные А.РНК являются ключевыми компонентами одной из систем негативной регуляции экспрессии генов как у бактерий, так и у эукариот. Для искусственного получения А.РНК в экспрессионный вектор вставляют нуклеотидную последовательность ДНК из целевого гена в обратной ориентации по отношению к промотору, чтобы транскрибировалась незначащая цепь гена с образованием А.РНК; затем на такой рекомбинантной плазмиде осуществляют синтез А.РНК (обычно в бактериальных клетках). Искусственная А.РНК используется в экспериментальной работе, а также как средство для лечения различных патологий. Использовать А.РНК для подавления экспрессии генов впервые было предложено Дж. Изантом и Г. Вайнтраубом в 1984 г
 
3.2) Использование рибозимов (M1 субъединица РНКазы P, hammerhead-рибозимы).
 
Одними из основных различий, обнаруживаемых между нормальными и раковыми клетками, являются генетические различия ряда генов, контролирующих пролиферацию. В геноме опухолевых клеток часто  обнаруживают мутации в генах  двух типов: онкогенах и генах-супрессорах опухолевого роста, или антионкогенах.
Онкогены эволюционно консервативны  и вызывают неопластическую трансформацию  клеток как при ретровирусной инфекции в природных условиях (поскольку они часто бывают включены в состав генома ретровирусов), так и после введения ДНК онкогенов в культивируемые клетки с помощью трансфекции. Большинство онкогенов вначале было обнаружено именно в составе генома онкогенных вирусов, и они являются мутантными производными протоонкогенов, присутствующих в здоровых клетках многоклеточных организмов и активирующихся во время эмбриогенеза, роста клеток или регенерации тканей. Поскольку активированные онкогены в опухолевых клетках, как правило, сверхэкспрессируются и кодируемая ими РНК по своей первичной структуре отличается от РНК протоонкогенов, РНК онкогенов являются хорошей потенциальной мишенью для рибозимов. Мутация в кодоне 12 гена H-ras , приводящая к замене GGC на GUC, создает консенсусный сайт, по которому HH-рибозим может расщеплять мутантную мРНК. In vitro было продемонстрировано пятикратное различие в эффективности действия рибозима на мутантную H-ras-РНК и соответствующую РНК дикого типа. Получены H-ras-зависимые линии клеток, стабильно трансформированные экспрессирующим вектором, который направлял синтез HH-рибозима под контролем промотора бета-актинового гена. Для таких клеток характерна пониженная скорость пролиферации, сопряженная с уменьшением внутриклеточных уровней H-ras-РНК и белка р21 , кодируемого этим геном. Далее рибозим экспрессировали в клетках линии EJ карциномы мочевого пузыря человека . Введение исходных клеток мышам сопровождалось их быстрой гибелью на фоне развития высокоинвазивных опухолей. В отличие от этого клоны EJ-клеток, экспрессирующих рибозим, в организме мышей обладали резко сниженным опухолевым фенотипом. Образующиеся опухоли были малоинвазивны, и наблюдалось приблизительно двукратное повышение уровня выживаемости мышей с трансплантатами. Гистологические исследования подтверждали слабую способность опухолей к метастазированию. Рибозимы в опухолях обнаруживались методом ПЦР на протяжении 86-90 дней.  елковый продукт гена c-fos участвует в передаче сигнала эукариотическими клетками, вовлечен в синтез ДНК и может придавать клеткам устойчивость к противоопухолевым препаратам. Последние два свойства этого белка находят подтверждение в том, что при проведении лечения часто используемым противоопухолевым лекарством цисплатином (цис-диаминодихлорплатина) происходит индукция гена c-fos вслед за генами dTMP-синтазы и ДНК- полимеразы .
Рибозим, разрушающий c-fos-мРНК, снижал конечный уровень экспрессии гена c-fos, приводил к повышению чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим агентам (включая цис- платину) и значительно подавлял экспрессию генов dTMP-синтазы, ДНК-полимеразы бета и гена металлотионеина человека hMTII-A .
Аберрантная филадельфийская хромосома образуется в результате транслокации (9;22)(q34;q11) в стволовых клетках костного мозга, что сопровождается слиянием генов bcr и abl с образованием химерного онкогена bcr/abl и развитием хронических миелоидных лейкозов (ХМЛ) . Транскрипт химерного гена кодирует белок р210bcr/abl , который обладает повышенной активностью тирозинкиназы. Такие РНК и белок обнаруживаются почти у всех больных с синдромом ХМЛ, а также у 50% пациентов с острым лимфобластоидным лейкозом , у которых имеется филадельфийская хромосома.
С помощью рибозимов, специфически расщепляющих последовательность химерной мРНК в месте стыковки последовательностей двух генов, удалось подавить экспрессию химерного гена bcr/abl в культивируемых клетках.
Экспрессия рибозимов в культивируемых клетках вызывала снижение уровня bcr/abl-мРНК, полностью блокировала образование химерного белка р210bcr/abl и ингибировала рост клеток на 84%. Эти результаты были значительно лучше эффектов, вызываемых антисмысловыми олигонуклеотидами.
В других работах был получен  рибозим, расщепляющий химерную РНК по кодону GUU, расположенному по соседству с местом стыковки последовательностей двух генов. Этот рибозим разрушал соответствующую РНК in vitro и in vivo, а также подавлял тирозинкиназную активность белка р210.
 
3.3) Использование РНК интерференции.
 
РНК-интерференция  – подавление экспрессии генов с  помощью двухцепочечной РНК – была открыта в середине 90-х годов ХХ века при изучении круглого червя Caenorhabditis elegans. Во всех случаях основным действующим агентом РНК-интерференции служит так называемая малая интерферирующая РНК, которая представляет собой короткую молекулу двухцепочечной РНК длиной 19 пар нуклеотидов с выступающими с каждого 3\'-конца двумя неспаренными нуклеотидами. В цитоплазме siRNA связывается с белками-ферментами, при этом образуется комплекс RISC (RNA-induced silencing complex) . Один из ферментов RISC, хеликаза, расплетает двухцепочечную siRNA, после чего в составе комплекса остается одна (направляющая) цепь siRNA, которая узнает участок с комплементарной последовательностью (мишень РНК-интерференции) в молекуле мРНК и связывается с этим участком. Вторая (пассажирская) цепь siRNA разрушается. Связывание служит сигналом для другого фермента RISC, рибонуклеазы, делающей одиночный разрыв мРНК в области комплементарного взаимодействия. Образовавшиеся в результате фрагменты мРНК быстро расщепляются затем другими внутриклеточными рибонуклеазами. Таким образом, при РНК-интерференции подавление экспрессии индивидуальных генов происходит за счет деградации соответствующих мРНК и, следовательно, уменьшения синтеза соответствующих белков. 
Поскольку одним из основных свойств описанного процесса является высокая специфичность, вскоре после открытия РНК-интерференции стало понятно, что этот феномен может иметь огромное практическое значение. Действительно, за последние несколько лет появилось много работ, в которых описывается использование технологии РНК-интерференции для изучения функций генов (functional screening) , выбора мишеней для терапевтического воздействия, подтверждения правильности выбора этих мишеней (target identification and validation)  и, наконец, для генотерапии прежде всего вирусных и онкологических заболеваний.
Суть механизма РНК-интерференции  заключается в том, что при  введении в клетки короткой двунитевой РНК (днРНК) она способна вызывать специфическое разрушение той мРНК, с которой имеет гомологию. Сначала днРНК разрезается специальным ферментом на короткие фрагменты размером от 19 до 21 пар нуклеотидов. После небольших химических модификаций эти короткие днРНК образуют специфический комплекс с определенными клеточными белками. В этом комплексе днРНК расплетается и становится однонитевой. Затем короткая однонитевая РНК в силу своей комплементарности взаимодействует со строго определенной мРНК (копией гена-мишени), что является сигналом для "разрезания" последней ферментами комплекса. Образующиеся в результате этого короткие фрагменты мРНК уже не способны обеспечивать синтез полноценного белка. Таким образом, конструируя различные днРНК можно подавлять синтез строго определенных белков в клетке, не изменяя при этом структуру кодирующих их генов.
3.4) Использование интрател.
 
Интратела — семейство антител, обладающих специфичностью и высоким сродством связывания антиген в сочетании с их устойчивой способностью локализоваться в определенных местах внутри клетки. И. могут быть использованы в качестве терапевтического средства, мишенью которого является конечный продукт энзиматической реакции.
 
3.5) Использование доминантно-негативных  белков.
 
Мутации в антионкогене р53 обнаруживают в 50% солидных опухолей у человека. Продукт гена р53 выполняет функции активатора транскрипции других генов, ингибирующих переход нормальных клеток от фазы G1 к S-фазе клеточного цикла . Внутриклеточный уровень этого белка возрастает в ответ на повреждение геномной ДНК, что сопровождается задержкой клеток в фазе G1 и репарацией повреждений, а также терминальной дифференцировкой или же, если повреждения ДНК оказываются слишком большими, - апоптозом - генетически запрограммированным самоубийством клеток.
Инактивация белка р53 ассоциируется с неконтролируемым ростом опухолевых клеток многих типов. Было установлено, что введение функционально активного трансгена р53 в клетки с поврежденным геном белка р53 подавляет рост опухолевых клеток или индуцирует в них апоптоз.
 
3.6) Использование аптамеров.
 
Аптамеры являются высокоаффинными и очень специфичными лигандами. Аптамеры к белкам часто связываются в функционально-важных участках молекулы и являются ингибиторами активности белков-мишеней .По большинству своих характеристик аптамеры не уступают моноклональным антителам и могут быть использованы вместо антител во многих экспериментах. В то же время, аптамеры обладают значительно большей стабильностью, чем антитела.Обасти применения аптамеров.
1) Аптамеры используют для изучения механизмов взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. В случае белков, узнающих специфические последовательности нуклеиновых кислот in vivo, использование SELEX позволяет выявить природные последовательности связывания белков с РНК или ДНК. Анализ трехмерной структуры аптамер-белковых комплексов используется для исследования структуры РНК- и ДНК-связывающих сайтов белков-мишеней.
2) На основе аптамеров могут быть получены высокоэффективные и специфичные ингибиторы белков-мишеней. Подобные ингибиторы могут использоваться как в фундаментальных исследованиях (в частности, в функциональных исследованиях белков-мишеней), так и для создания новых лекарственных средств. Мишенями в данном случае могут являться, например, различные факторы роста, гормоны, ферменты, рецепторы на клеточной поверхности, токсины, белки вирусов и патогенных микроорганизмов. Несколько лекарств на основе аптамеров в настоящее время проходят клинические испытания, а первый из препаратов уже поступил на фармацевтический рынок. Кроме непосредственного применения аптамеров в качестве специфических ингибиторов, их можно использовать для поиска новых ингибиторов различных белков. С этой целью проводится направленный поиск молекул, конкурирующих с аптамером-ингибитором за связывание с белком-мишенью и, таким образом, взаимодействующих в том же участке белка, что и исходный аптамер.
3) Аптамеры находят широкое применение для детекции различных молекул-мишеней (в том числе в диагностических целях). Было показано, что аптамеры могут с успехом заменить антитела в методиках ELISA, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), Вестерн-блоттинга и др. Аптамеры используют для измерения концентрации различных метаболитов и белковых факторов, для обнаружения токсинов, выявления специфических типов клеток и тканей, клеток болезнетворных микроорганизмов. Кроме того, аптамеры, как и антитела, можно использовать для аффинной очистки и идентификации белков-мишеней Наиболее перспективным с точки зрения диагностики является создание микрочипов, содержащих в своем составе большое количество аптамеров, которые могут быть использованы для одновременного анализа многих молекул-мишеней . Созданы чипы, позволяющие анализировать концентрацию некоторых факторов роста в крови человека. В дальнейшем предполагается создать микрочипы для анализа экспрессии большого числа различных белков человеческой клетки, что должно иметь огромное значение для развития методов диагностики различных заболеваний, а также в фундаментальных исследованиях.
 
3.7) Использование цинк-связывающих  белков, блокирующих транскрипцию.
 
Белки цинковый палец взаимодействуют через  их индивидуальные пальцев до трех пар оснований дочерних сайтов на ДНК-мишени. Четыре ключевых  Остаток позиции -1, 2, 3 и 6 на альфа-спирали цинковых пальцев у водородных связей взаимодействия с ДНК.
Mutating этих ключевых остатков позволяет генерировать множество комбинаторных возможностей, которые можно привязать к любому ДНК растянуть интерес. Используя привязку специфичность и аффинность взаимодействия между цинковых пальцев и соответствующих ДНК может помочь создать инженерных пальцы цинка в терапевтических целях с участием генома ориентации. Изучение структурно-функциональных отношений существующих цинковый палец-ДНК может помочь в прогнозировании.Вероятно пальцы цинка, который может связываться с любым ДНК-мишени. Вычислительных средств облегчить прогнозирование таких инженерных
цинковых  пальцев путем эффективного использования  информации из имеющихся экспериментальных  данных.
 
 
II. Прямое убийство раковых клеток.
 
    Использование генов-самоубийц, генов, кодирующих потенциально токсические для раковых клеток молекулы или генов, кодирующих промоторы апоптоза.
Терапия, инициирующая апоптоз опухолевых клеток. Апоптоз клетки можно
запустить с  помощью многих факторов. Например, апоптоз можно вызвать, усилив
чувствительность  клетки к повреждениям ДНК. Этому  способствует введение
генетических  конструкций, усиливающих или запускающих  подавленную или полностью отсутствующую  в опухолевых клетках экспрессию клеточных белков (р53, E2F-1). К запуску самоубийства клеток приводит введение непосредственно
проапоптотических генов - генов, кодирующих предшественников каспаз; генов, чьи продукты блокируют ингибиторы апоптоза (IAP); генов, кодирующих участников митохондриального пути апоптоза (Apaf-1, Bax).
Введение  в опухолевую массу лигандов для  мембранных рецепторов апоптоза приводит опухолевые клетки к гибели. Наилучшие результаты в доклинических исследованиях получены при использовании рекомбинантного лиганда TRAIL, который, в отличие от Fas-лиганда и TNF-a, не оказывал токсичного действия на окружающие ткани.
Часто многие опухолевые клетки имеют пониженную экспрессию рецепторов апоптоза, в частности DR4-рецепторов для TRAIL. Поэтому генную терапию с помощью TRAIL предваряют терапией, способствующей повышению экспрессии DR4-рецепторов (повышенная экспрессия р53, блокада ингибиторов апоптоза IAP и Smac/Diablo).
Большинство опухолей устойчивы к действию цитотоксических препаратов. Одной из составляющих, способствующему этому, а также препятствующему запуску апоптоза, является каскад реакций, индуцированный фактором транскрипции NF-kB. Поэтому была разработана соответствующая генная терапия протеолитически стабильным «суперрепрессором» этого каскада IkB, который повышает чувствительность некоторых видов опухолей к химиотерапии, TNF-a. Подобный эффект оказывают ингибиторы протеасом, протеинкиназы С.
Одним из важных подходов в рамках апоптозной стратегии генной терапии является «суицидальная» GDEPT-терапия (gene directed enzyme prodrug therapy). Эта терапия способствует повышению чувствительности раковых клеток к апоптозу с помощью нетоксичных предшественников противоопухолевых препаратов.
Апоптоз пролиферирующих клеток можно вызвать  с помощью препарата ганцикловир, который оказывает токсичное действие на быстроделящиеся клетки. Он представляет собой активированный продукт гена тимидинкиназы вируса простого герпеса. Для апоптоза опухолевых клеток их сначала заражают вирусом простого герпеса, несущего ген тимидинкиназы, а затем через некоторое время вводят ганцикловир. Тимидинкиназа вируса фосфорилирует ганцикловир.
Киназы клетки-хозяина присоединяют к фосфорилированному ганцикловиру
трифосфат, а трифосфаты затем включаются во вновь синтезированную ДНК в процессе синтеза ДНК при клеточном делении. Включившись, они обрывают дальнейший синтез ДНК, терминируют его, что приводит к запуску апоптотических сигналов. В результате клетки, содержащие герпесную тимидинкиназу, погибают в присутствии этих агентов.
Через межклеточные контакты ганцикловиртрифосфат может попасть в другие опухолевые клетки и привести к их гибели.
Подобные  эксперименты вначале велись на животных моделях. Клетки мышиных
фибробластов, продуцирующие рекомбинантные ретровирусы подсаживались прямо в опухоль в мозге. Рекомбинантные ретровирусы содержали ген HSVtk. Поскольку ретровирусы интегрируют в митотически активные клетки, ген тимидинкиназы оказывался преимущественно в опухолевых клетках, тогда как здоровые клетки из тканей, окружающих опухоль, оставались вне вирусной атаки и, следовательно, без гена тимидинкиназы герпеса.
Фосфорилированный ганцикловир может диффундировать от клеток, в которых он образуется за счет работы вирусной тимидинкиназы, к соседним клеткам. Если соседние клетки делятся, то они будут его включать в состав ДНК и погибать. Экспериментально показано, что если 10% клеток опухоли содержит ген тимидинкиназы, то опухоль может быть уничтожена полностью. И при этом у животных не наблюдается токсических эффектов.
Полученные  результаты позволили начать испытания  на больных раком мозга, которым  инъецируют мышиные фибробласты, продуцирующие  рекомбинантные ретровирусы, содержащие ген HSVtk, а затем внутривенно вводили ганцикловир.
 
    Использование генов, кодирующих опухолевые суппрессоры.
 
Направленное убийство опухолевых клеток. Это может осуществляться путем
введения  генов, кодирующих токсины под контролем  промоторов, специфически
экспрессирующихся в опухолевых клетках. Например, гена, кодирующего дифтерийный токсин.
Другой недавно  разработанный генотерапевтический подход заключается в использовании штамма аденовируса, кодирующего дефектный белок Е1В. Этот белок с молекулярной массой 55 кДа в обычных условиях обладает сродством к одному из основных онкосупрессоров р53. При взаимодействии с ним он блокирует его действие. В результате генетического дефекта Е1В в сайте взаимодействия с р53 при попадании в нормальные клетки не происходит нарушения активности р53 и дальнейшего развития вируса. Большинство опухолевых клеток несет мутации именно в гене, кодирующем белок р53, поэтому при попадании аденовируса в эти клетки блокады репликации аденовируса не происходит. Вирус размножается и осуществляет свое цитопатическое действие. Этот подход был отработан на животных моделях и в настоящее время
используется  в клинических целях, обычно в  сочетании с дополнительной химиотерапией.
Для восстановления нормального фенотипа осуществляют блокаду экспрессии онкогенов с помощью внутриклеточной иммунизации, например, путем введения в клетки конструкций, программирующих синтез антисмысловых РНК или антител к онкобелкам. Ведутся исследования по использованию внутриклеточных антител для инактивации рецепторов ростовых факторов, которые вовлекаются в опухолеобразование. К числу таких рецепторов относится ErbB2. Он принадлежит к семейству рецепторов эпидермального ростового фактора EGFR. Функционально это семейство представляет собой семейство рецепторов с тирозинкиназной активностью, которая имеет ключевое значение для регуляции жизнедеятельности клетки. Этот рецептор повышенно экспрессируется на клетках ряда опухолей (карцинома яичника, молочной железы). На культурах клеток продемонстрировали, что внутриклеточные антитела к этому рецептору, заякоренные в эндоплазматическом ретикулуме, предотвращали его появление на поверхности клеток и приводили к приостановке клеточной пролиферации. Наблюдали и обращение трансформированных клеток к нетрансформированному фенотипу.
Использовали, в частности, антитела против продукта гена ras. Это p21ras белок, связывающий гуанозиннуклеотиды и вовлеченный в многочисленные процессы контроля клеточного роста и дифференцировки. Введение в опухолевые клетки генов онкосупрессоров, таких как p53, также способствует восстановлению нормального фенотипа опухолевых клеток.
 
4). Использование цитотоксических лимфоцитов
были использованы Т-лимфоциты, инфильтрующиеся в опухоль (ТИЛ). ТИЛ брали у онкологических пациентов и с помощью ретровирусного вектора вводили в них ген устойчивости к неомицину. Модифицированные ТИЛ растили в культуре в присутствии фактора роста Т-лимфоцитов IL-2. Затем Т-лимфоциты вводили пациентам.
Клинические исследования показали безвредность введения генетически модифицированных Т-лимфоцитов. Однако, осталось неясным, насколько специфично лимфоциты мигрируют в опухоль.
Дальнейшие  эксперименты велись также с ТИЛ, но в качестве терапевтического гена брали ген, кодирующий фактор некроза  опухолей (ФНО). ФНО представляет лимфокин, который оказывал сильный противоопухолевой эффект, что было подтверждено в опытах на мышах. Однако, при экстраполировании этих экспериментов на человека, введение ФНО оказывалось очень токсичным для организма в целом. Но несмотря на первые неудачи, клинические испытания с использованием ТИЛ для генной терапии опухолей активно ведутся вплоть до настоящего времени, также как и дискуссии на тему эффективности такого подхода.
Другой подход предполагает изменение функционирования клеток-эффекторов при
помощи генов, кодирующих химерные рецепторы. Такие  рецепторы включают
вариабельные  домены противоопухолевых моноклональных антител и константные
участки цепей  Т-клеточного рецептора. При экспрессии таких рецепторов распознавание опухоли и последующая активация цитотоксических Т-клеток не зависят от антигенов гистосовместимости.
Еще одно направление  связано с клонированием и  размножением ex vivo Т- лимфоцитов, несущих гены, которые кодируют Т-клеточные рецепторы, направленные против опухолевых антигенов.
 
III. Непрямое убийство раковых клеток
    Пассивная иммунотерапия
      Использование вакцин на основе БЦЖ
Один из эффективных  методов — это внутрипузырная БЦЖ-терапия. Вакцина БЦЖ — это взвесь жизнеспособных бацилл КальметтаГерена (Calmette-Guerin). Внутриклеточно размножаясь, они стимулируют местный иммунитет, в котором задействованы макрофаги, Т-лимфоциты и цитокины. В 20 исследованиях, проведенных с использованием различных форм поддерживающей БЦЖ-терапии, отмечено снижение шансов прогрессирования рака на 37 %. Более того, клинически доказано, что вакцина БЦЖ более эффективна по сравнению с митомицином С.
БЦЖ - это  вакцина, приготовленная на основе бактерии Mycobacterium bovis, которая вызывает туберкулез у крупного рогатого скота. Для человека БЦЖ не опасна, но обладает способностью активировать иммунитет. Вакцина БЦЖ действует наподобие цитокинов, усиливая работу всей иммунной системы. Непосредственно на клетки меланомы вакцина не влияет. Иногда она используется при лечении меланомы стадии III и вводится в саму опухоль.

      использование иммуностимуляторных цитокинов (интерлейкин -2, интерлейкин-4, интерлейкин-12;  интерферон альфа, бэта, гамма;  фактор некроза опухолей альфа,  GM-CSF)
Добавление  других цитокинов, например IL-4, IL-13, IL-15 или TNF-, противодействовало эффектам выделения, связанным с активацией этих клеток. Использование на практике способов данного изобретения обеспечивает простой и более экономичный  способ получения и поддержания  незрелых дендритных клеток с состоянии, оптимизированном для поглощения, процессинга и презентации выбранного антигена.
Новые гены можно внедрить в клетки с тем, чтобы на их поверхности экспонировались  новые белки. Новые белки включают иммунную сигнализацию и стимулирование молекул, например, такого цитокина, как  интерлейкин-2, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и других стимулирующих молекул. Генетически-измененные вакцины опухолевых клеток создают клетки, которые синтезируют опухолеспецифические антигены, так же как и новые иммуностимуляторные молекулы на их клеточной поверхности. Эти клетки могут быть введены пациенту. Комбинация молекул на поверхности ведет к усиленному иммунному ответу. Добавленные молекулы на поверхности измененных опухолевых клеток стимулируют иммунную систему, чтобы атаковать даже те клетки опухоли, которые остались в организме и не имеют новых белков на своей поверхности.
интерлейкины – это цитокины, которые организм производит естественным образом, и которые можно получить в лаборатории. Определены многие интерлейкины. Применение интерлейкина-2 (альдеслейкина) в лечении рака наиболее изучено. Интерлейкин-2 стимулирует рост и активность многих иммунных клеток, таких как лимфоциты, которые разрушают раковые клетки. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило применение интерлейкина-2 для лечения метастатического рака почки и метастатической меланомы.  
Интерлейкин-2 (ИЛ-2) применяют через 10-14 суток после  введения вакцины в дозе 100000-125000 МЕ на м2 поверхности тела в день, внутривенно капельно, в течение 4 часов. Курс лечения состоит из 15-60 введений. Затем проводят поддерживающую иммунотерапию ИЛ-2 в течение 6-12 месяцев, с интервалом 2 месяца. ИЛ-2 вводят ежедневно, 4 дня, в дозе 125000 МЕ на м2.
Гамма-интерферон (ИФН-?) применяется по следующей схеме: внутримышечное введение 1000000 МЕ ИФН-g через день – 1 месяц, затем 2 месяца – 1 раз в неделю. Гамма-интерферон начинают вводить через день после инъекций вакцины РЕСАН.
Если есть возможность во время основного  курса иммунотерапии доставлять ИЛ-2 и ИФН-? непосредственно к опухоли, то это наиболее предпочтительный вариант.
Интерферон (ИФН), также как и интерлейкин_2 (ИЛ_2), не является типичным противоопухолевым  препаратом. Тем не менее, его можно  отнести к классу средств, обладающих противоопухолевым действием, благодаря  целому ряду биологических свойств, включая влияние на процессы программированного клеточного роста, дифференцировку  и другие клеточные функции. По структуре  ИФН – это секреторные гликопротеины. На сегодняшний день известно 5 типов  ИФН (альфа, бэта, гамма и еще 2). У человека ИФН альфа, бета, гамма кодируются 3 различными генами и, следовательно, существует лишь один тип каждого из этих интерферонов. ИФН альфа кодируется 25 генами, что объясняет существование 25 различных
подтипов  ИФ альфа. На долю ИФН альфа приходится 90% всех альфа_ИФН. На практике
широко используются 2 разновидности рекомбинантного  ИФН – интерферон альфа (роферон А) и интерферон_альфа (интрон А, реаферон). Биологическая активность ИФН заключаются в их противовирусном, противомикробном, антипролиферативном и иммуномодулирующем действии. Антиканцерогенные свойства ?_ИФН связаны со способностью стимулировать систему репарации ДНК, модулировать экспрессию генов, вовлеченных в процесс канцерогенеза, подавлять клеточную репликацию онковирусов, контролировать ангионеогенез, активировать эффекторные клетки (Т_лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки), а также увеличивать клеточную адгезию, продукцию других цитокинов. Более чем в 50% случаев солидные опухоли (меланома, колоректальный рак, рак шейки матки, рак молочной железы, мелкоклеточный рак легкого, хорионкарцинома) утрачивают один или большее число аллелей главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I. В то же время молекулы MHC I класса, представленные на поверхности опухолевых клеток, являются мишенями для макрофагов, которые запускают противоопухолевую иммунную реакцию. ИФН регулирует экспрессию МНС_антигенов I типа на поверхности опухолевых клеток и МНС_антигенов II типа на макрофагах, что делает опухолевую клетку уязвимой для различных эффекторов иммунной системы. Помимо антипролиферативного действия, ИФН влияет также на различные физиологические параметры клеток. Он вызывает изменения цитоскелета, включая повышение структурированности микрофиламентов, перераспределение фибронектина, увеличение объема клеток, которые становятся более уплощенными, повышение ригидности плазматической мембраны и снижение подвижности клеток. Эти эффекты играют существенную роль в противоопухолевой активности.
Интерлейкины объединяются следующими общими свойствами: 1) синтезируются клетками иммунной системы в процессе реализации механизмов естественного или специфического иммунитета; 2) проявляют свою активность при очень низких концентрациях (порядка 10_11 моль/л); 3) служат медиаторами иммунной и воспалительной реакций и обладают аутокринной, паракринной и эндокринной активностью; 4) действуют как факторы роста и дифференцировки клеток (при этом вызывают преимущественно медленные клеточные реакции, требующие синтеза новых белков); 5) образуют регуляторную сеть, в которой отдельные элементы обладают синергическим или антагонистическим действием; 6) обладают полифункциональной активностью.
 
    Активная иммунотерапия.
      прямая иммунизация немодифицированными раковыми клетками.
 
Цель онковакцины - стимулировать распознавание, атаку и уничтожение опухолевых клеток иммунной системой. В отличие от вакцин для профилактики инфекционных болезней, онковакцины направлены на лечение. Существует несколько типов онковакцин, среди которых есть основанные на нуклеиновых кислотах, на моноклональных антителах и на клетках. Среди клеточных вакцин выделяют основанные на дендритных и на опухолевых клетках. Также используются комбинации различных методов и генетическая модификация клеток.
 
Вакцины, основанные на опухолевых клетках:
 Цельные  опухолевые клетки, обезвреженные  радиоактивным излучением и смешанные  с усилителем иммунологического  действия (адъювантом), были одной  из самых ранних форм клеточной  терапии. Этот подход позволяет  обойти необходимость идентификации  опухолевых антигенов перед терапией  и позволяет получить в данной  вакцине сочетание всех значимых  антигенов. Начальные клинические  испытания показали безопасность  этого подхода - побочные эффекты  сводились преимущественно к  местным реакциям в области  инъекции. Иммуногенность таких   вакцин может быть улучшена  использованием опухолевых клеток  с привнесёнными генами, кодирующими  ключевые компоненты иммунного  ответа (цитокины, например, такие как  гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, и костимулирующие молекулы).
 
 Цельноклеточные вакцины прошли клинические испытания. Melacine® (Corixa Corporation) состоит из лизированных клеток двух клеточных линий меланомы человека и запатентованного адъюванта. Она одобрена к применению при метастатической меланоме в Канаде. На рынке США цельноклеточные вакцины пока отсутствуют.
 
Аутологичные клеточные вакцины
Аутологичные клеточные вакцины разрабатываются компанией AVAX Inc. После хирургического извлечения злокачественной опухоли пациента опухолевые клетки обрабатывают динитрофенилом (ДНФ), химическим веществом, известным как гаптен, связывающимся с поверхностью клетки и усиливающим иммунный ответ. Обработанные ДНФ клетки смешивают с адъювантом, позволяющим увеличить их иммуногенную эффективность, и вводят обратно пациенту. Иммунная система после этого способна лучше находить, распознавать и атаковать оставшиеся опухолевые клетки, которые, возможно, метастазировали в другие части организма. Эти оставшиеся опухолевые клетки, не будучи распознанными и уничтоженными, потенциально способны давать новые опухоли, зачастую ведущие к гибели пациента. Иммунные реакции помогают выявить, какие чужеродные белки атаковать. Способность ДНФ модифицировать белки и облегчать иммунной системе идентификацию их как чужеродных была доказана более 30 лет назад. Технология аутологичных клеточных вакцин использует эти механизмы как по отношению к белкам, так и к другим молекулам, воздействуя на иммунную систему пациента для предотвращения рецидива и улучшения выживаемости.
 
Вакцины, использующие одновременно различные опухолевые антигены.
Злокачественная опухоль сложна для высокоточной, прицельной терапии еще и из-за того, что из-за постоянных мутаций  её клеток она представляет собой  гетерогенную популяцию. Это означает, что какой-либо маркёр или антиген  может присутствовать в одних  и отсутствовать в других клетках  опухоли. Onyvax Ltd Cell Vaccines решает эту проблему одновременным введением множества опухолевых антигенов. Эти вакцины производят из нескольких иммортализованных клеточных линий, которые представляют различные стадии дифференцировки опухолей. За счет этого увеличивается эффективность вакцины и снижается вероятность развития побочных эффектов по сравнению с недифференцированной по стадиям терапией. Этот подход, в частности, эффективен в случаях, когда мало известно о клеточном составе потенциальной мишени определённого опухолевого типа, как при раке простаты. Onyvax ведёт клинические испытания продукта для лечения рака простаты и находится в начале завершающей стадии.
 
      прямая иммунизация модифицированными раковыми клетками.
 
Более современный  подход - использование вакцин, содержащих генетически модифицированные клетки. Иммунная система пациента должна различать  здоровые и опухолевые клетки. При  этом опухолевые воспринимаются как  чужеродные или больные. Однако иногда опухолевые клетки способны индуцировать иммунологическую толерантность,  нарушая  распознавание клеток и адекватную работу врождённого и приобретённого иммунитета. Цель многих подходов клеточной  и генной терапии - позволить иммунной системе распознать и уничтожить опухолевые клетки так же, как она  делает это с клетками, пораженными  вирусной инфекцией. Для ликвидации толерантности к опухолевым клеткам  эти клетки необходимо модифицировать переносом генов. Затем эти генетически  модифицированные опухолевые клетки вводят пациенту. Наиболее распространённая генная модификация вакцин использует цитокины - они продуцируются в  высоких концентрациях по соседству  с опухолевыми клетками и, активируя  местные иммунологические реакции, усиливают работу антигенпрезентирующих клеток и, следовательно, опухолеспецифических Т-лимфоцитов. Это позволяет избежать побочных эффектов, связанных с системной терапией цитокинами. Примером такой вакцины служит описанная ниже GVAX вакцина.
 
Опухолевая  вакцина GVAX
Cell Genesys разрабатывает GVAX вакцины, состоящие из облучённых опухолевых клеток аутологичного происхождения или полученные из опухолевых клеточных линий (аллогенные). Эти опухолевые клетки генетически модифицировали, чтобы получить синтез ими иммуностимулирующего гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), способного стимулировать иммунный ответ в отношении как обнаружения, так и уничтожения опухолевых клеток, возможно, оставшихся после хирургического вмешательства и/или химио-радиотерапии. Закончены пять клинических испытаний (1-2 фазы) вакцин в терапии почечноклеточной карциномы, меланомы, рака простаты. Важным преимуществом противоопухолевых вакцин GVAX  является то, что они представляют собой цельноклеточные вакцины, для которых не требуется выделения специфических опухолевых антигенов. Какие именно противоопухолевые антигены наиболее эффективны терапевтически - неизвестно, поэтому подход Cell Genesys использует множество опухолевых антигенов и преодолевает необходимость прицельного выделения специфических наиболее эффективных при вакцинотерапии опухоли антигенов. Были получены доказательства того, что GVAX продемонстрировала противоопухолевую активность в отношении всех пяти типов опухолей, которые были включены в испытания (рак простаты, рак поджелудочной железы, рак лёгкого, меланома, опухоли почки). Это наводит на мысль, что GVAX может применяться при многих типах опухолей (Jaffee et al 2001). Применяются также пациент-специфичные вакцины GVAX, полученные из собственных опухолевых клеток пациента при использовании аденовирусной системы доставки генов, разработанной компанией. В условиях госпиталя процесс изготовления вакцины занимает около суток. В настоящее время Cell Genesis проводит 2 фазу клинических испытаний противоопухолевой вакцины GVAX при раке простаты, 1-2 фазы противомиеломной вакцины и в 2001 году инициировала дополнительные клинические испытания как по этим онконозологиям, так и по раку поджелудочной железы и лейкемии.
 
      использование дендритных ктеток
 
Основы  дендритноклеточных вакцин
Дендритные  клетки (dendritic cells – DCs) названы так за длинные отростки и представляют собой систему лейкоцитов, широко представленную во всех тканях, особенно в тех, которые обеспечивают контакт с внешней средой. DCs происходят из костномозговых предшественников и до миграции в периферические ткани незрелые клетки циркулируют в кровяном русле. В тканях DCs дифференцируются и активизируются, принимая участие в процессинге тканевых антигенов, обеспечивая их презентацию на своей поверхности вместе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC). При соответствующей стимуляции происходит дальнейшее созревание DCs и они мигрируют во вторичные лимфоидные органы, где представляют антигены Т-клеткам и таким образом индуцируют иммунный ответ. Дендритные клетки могут быть получены из CD-34+ предшественников, в ответ на воздействие г-КСФ и фактор некроза опухоли (FNT) и из моноцитов, культивируемых в присутствии макрофагального КСФ и интерлейкина-4. DCs обладают способностью инициировать Т-клеточный ответ и рассматриваются как потенциально эффективная вакцина для иммунотерапии в онкологии.
 
Преклинические и клинические исследования DC вакцин
Дендритные  клетки являются наиболее мощными антигенпрезентирующими клетками и единственными, способными представлять новые антигены неактивированным Т-клеткам. Большое число DCs может быть получено in vitro в присутствии соответствующих цитокинов из адгезивной мононуклеарной фракции периферической крови или CD-34+ предшественников. Препараты, содержащие DCs для применения в онкологии:
 
DCs сепарированные по градиенту плотности и прошедшие селекцию по соответствующим маркёрам (CMRF-44+, CMRF-56+).
 
DCs полученные из адгезивной фракции мононуклеаров и сортированные по CD-14+
 
DCs, полученные из гемопоэтических стволовых клеток сортированных по CD-34+
 
Несколько преклинических исследований продемонстрировали эффективность нагруженных антигенами дендритных клеток в получении опосредованного противоопухолевого ответа. Клинические испытания показали, что DCs - перспективный инструмент для иммунотерапии опухолей. В этих исследованиях у пациента забирали клетки белой крови, культивировали вне организма в присутствии цитокинов на протяжении определённого периода времени (обычно 10-11 дней) и полученные DCs  перед обратной инфузией пациенту «нагружали» опухолевыми антигенами. Вакцина BLP25 (Biomira Inc), основанная на лицензионной технологии Cancer Vac Ltd, находится на стадии 2б фазы рандомизированного клинического исследования с участием пациентов, больных метастатической формой немелкоклеточного рака лёгкого. Цель исследования - получение доказательств безопасности препарата и свидетельства его положительного влияния на выживаемость пациентов. В основе этой вакцины лежит мощный первичный Т-клеточный ответ (направленный на анти-MUC1), получаемый в результате сокультивирования DCs человека с липосомами BLP25 и последующего введения в культуру аутологичных Т-лимфоцитов.
 
Центр клеточной  и генной терапии, расположенный  в медицинском колледже Бейлора (Хьюстон, Техас) проводит 3 фазу испытаний экспериментального препарата, стимулятора созревания дендритных клеток, состоящего из множества цитокинов. Обработанные препаратом DCs применяют у пациентов с рецидивирующей формой лимфомы Ходжкина.
28 компаний  развивают направление противоопухолевых  вакцин, основанных на клетках.  Из них 12 используют дендритные  клетки (см. таблицу).
 
Манипуляции с дендритными клетками in vivo
Исследователи клиники Мейо на модели низкоиммуногенной меланомы B16 показали, что терапевтическое воздействие введения B7-DCs перекрёстных антител приводит к повышению секреции IL-12 и иммунотерапевтическому эффекту (Radhakrishnan et al 2004). Манипуляции с дендритными клетками in vivo предпочтительнее для практического использования в клинике, чем иммунотерапия на основе дендритных клеток, использующая методики in vitro. Указанные перекрёстные антитела не являются пациент-специфичными и могут использоваться у всех больных.
 
Слияние дендритных и опухолевых клеток
Слияние опухолевых и дендритных клеток используется при  приготовлении пациент-специфичных противоопухолевых вакцин. Технология предусматривает объединение дендритных клеток пациента и его инактивированных опухолевых клеток, при использовании химического или электрослияния. Полученные клетки вводятся обратно пациенту. Технология слияния клеток опять же обходит необходимость идентификации соответствующих специфических опухолевых антигенов, так как они представлены в совокупности всех антигенов, полученных из опухоли. Однажды введённая, опухолевая вакцина стимулирует распознавание и уничтожение иммунной системой опухолевых клеток, имеющих антигены, представленные в вакцине. Антигены, фрагменты протеинов, представленных в опухолевых клетках, выполняют роль маркеров, направляющих иммунную реакцию на эти клетки. Благодаря тому, что вакцины вызывают системный иммунный ответ, они потенциально способны уничтожать опухолевые клетки во всём организме.
 
Как было показано на различных крысиных моделях, иммунизация  гибридами дендритных и опухолевых клеток приводила к возникновению  защитного иммунитета и препятствовала развитию опухолей. Имеются как данные работ in vitro, так и опубликованные результаты 1-2 фаз клинических испытаний среди пациентов с прогрессирующей метастатической почечноклеточной карциномой, в которых использовались предшественники дендритных клеток от здоровых людей, слитые с аллогенными либо аутологичными клетками опухоли пациента (Marten et al 2003). В последних было показано увеличение реактивности против возвращаемых антигенов, что наблюдалось у большинства пациентов в виде возросшей цитотоксичности лимфоцитов периферической крови к клеткам почечноклеточной карциномы и увеличения числа интерферон-продуцирующих клеток.
 
Высокопроизводительная  технология электрослияний, используя дендритные и различные мышиные и человеческие опухолевые клетки, способна давать хороший выход эффективных гибридов (15-54%) (Kuriyama et al 2004). Полученные клетки демонстрируют фенотип зрелых дендритных клеток и экспрессируют опухоль-ассоциированные антигены. В преклинических испытаниях на животных модели меланомы B16, трансдуцированной геном LacZ, однократная вакцинация мышей с опухолями, локализованными в лёгких, коже и мозге, привела к опухолевой регрессии и улучшению их выживаемости. Терапевтическая эффективность DCs гибридной вакцины сейчас оценивается в лечении пациентов с метастатической меланомой.
 
 Генетически модифицированные дендритные клетки
 При создании DCs-вакцин может быть использована  генная инженерия. Получаемые  in vitro дендритные клетки трансдуцируют генами, кодирующими опухолеспецифические антигены либо схожие с ними антигены или пептиды. Такие клетки могут быть использованы для индукции цитотоксического Т-клеточного ответа. Генно-инженерные  технологии для эффективного генного переноса используют рекомбинантные вирусные векторы, неспособные к репликации. Но наличие на мембране дендритных клеток вирусных (и поэтому чужеродных) антигенов кроме возможности усиления иммунного ответа несёт вероятность ускоренной элиминации этих клеток при последующих курсах иммунизации вследствие развития противовирусного иммунитета к обработанным таким образом дендритным клеткам. Один из способов преодоления этого - использование вирусных векторов, которые не приводят к презентации продуктов вирусных генов на поверхности клетки. Это такие векторы, как ретровирусные или «ослабленные» аденовирусные. Лентивирусы также могут использоваться в приготовлении DCs вакцин, но пока сведений об их использовании в доклинических испытаниях на животных нет. Перед ретровирусами у лентивирусов есть преимущество в том, что для эффективной трансдукции им не требуется репликация В-клетках-мишенях. Преимущество аденовирусов в том, что они обладают малой иммуногенностью за счёт малого количества вирусных эпитопов. В работе Ribas (Ribas et al 2002) обобщаются результаты 52 преклинических исследований противоопухолевых генетически-модифицированных DCs вакцин и представляется информация об оптимальных методиках генного переноса в дендритные клетки, алгоритме введения и механизмах последующего противоопухолевого эффекта. Эти данные смогут помочь выходу этих методов в клинику.
 
Будущее развитие DCs вакцин
DCs вакцины представляются наиболее перспективными среди всех противоопухолевых вакцин. В будущем DCs-клеточные вакцины будут включать использование моноклональных антител, генетическое модифицирование DCs, применение СВ-34+ предшественников, и станет возможной адресная доставка DCs к опухоли, использование лизатов опухоли или апоптозных клеток как источников дополнительных ещё не идентифицированных опухолевых антигенов.
При обработке  DCs комплексами моноклональных антител к ассоциированному с 1 комплексом гистосовместимости опухолевой клетки протеину А и самим этим протеином (он широко представлен во многих, если не всех, типах опухолевых клеток и практически не представлен в нормальных тканях), удаётся значительно усилить перекрёстную антигенпрезентацию опухолевых антигенов и инициировать поливалентный противоопухолевый CD8 и CD4 Т-клеточный ответ (Groh et al 2005). Это в значительной степени увеличивает силу иммунной реакции при сравнении с реакцией от индукции такого ответа иными агентами. Эти результаты стимулируют развитие DCs вакцин, предлагают основу для Т-клеточной терапии и продолжения исследований опухолевых антигенов.
Для увеличения нагруженности DCs онкопротеинами при манипуляциях in vitro и улучшения эффективности вакцин было предложено множество способов генетических коррекций и на экспериментальных опухолях показана их эффективность. DCs трансфецировали либо полинуклеотидами (ДНК или РНК), кодирующими опухолеспецифичные антигены либо ДНК, кодирующими иммуностимулирующие цитокины и ко-стимулирующие молекулы. Доставка в дендритные клетки генов, кодирующих антигенные эпитопы или другие молекулы, осуществляется рекомбинантн
и т.д.................


Перейти к полному тексту работы


Скачать работу с онлайн повышением уникальности до 90% по antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru


Смотреть полный текст работы бесплатно


Смотреть похожие работы


* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.