Здесь можно найти учебные материалы, которые помогут вам в написании курсовых работ, дипломов, контрольных работ и рефератов. Так же вы мажете самостоятельно повысить уникальность своей работы для прохождения проверки на плагиат всего за несколько минут.
Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp», которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение оригинальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения оригинальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, РУКОНТЕКСТ, etxt.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии так, что на внешний вид, файл с повышенной оригинальностью не отличается от исходного.
Результат поиска
Наименование:
реферат Роль и функции белков
Информация:
Тип работы: реферат.
Добавлен: 16.12.2014.
Год: 2014.
Страниц: 14.
Уникальность по antiplagiat.ru: < 30%
Описание (план):
Содержание
Введение
в биохимию. Краткая история биохимии.
История отечественной биохимии. Общая
характеристика обмена веществ. Понятие
об анаболизме, катаболизме и метаболизме.
Значение биохимии для врача.
Белки –
важнейшие компоненты организма. Функции
белков, строение, классификация и свойства
аминокислот. Обзор уровней структурной
организации белковой молекулы. Молекулярная
масса белков. Форма и размеры белковой
молекулы.
Принципы
определения структуры белка:
Определение
аминокислотной последовательности в
белках и олигопептидах;
Разделение
аминокислот с помощью ионообменной хроматографии;
Количественный
анализ полученных фракций;
Ферментативное
расщепление пептидов (с пепсином, трипсином,
химотрипсином, папаином);
Химическое
расщепление пептидов (с бромцианом);
Определение С-концевых аминокислот (с карбоксипептидазами)
Определение N-концевых аминокислот (дансил-хлоридом, динитрофторбензолом, фенилизотиоцианатом)
определение
первичной структуры белка (аминокислотной
последовательности);
методы
пептидных карт («метод отпечатков пальцев»).
Изучение
пространственной структуры белковой
молекулы (вторичная, третичная, четвертичная
структуры):
Рентгеноструктурный
анализ.
Изучение
трехмерных моделей белка (Protein Data Bank).
Представление
о нативно-развернутых белках – функционально-активн й форме белков в клетке.
1.1 Биохимия - это наука, изучающая качественный
и количественный состав, а также пути,
способы, закономерности, биологическую
и физиологическую роль превращения вещества,
энергии и информации в живом организме.
Современная биохимия сформировалась
на рубеже ХIХ и ХХ вв. в недрах органической
химии и физиологии, поэтому в ХIХ в. она
называлась физиологической химией. Термин
биохимия был предложен в 1858 году австрийским
врачом и химиком Винцентом Клетцинским.
История биохимии отражает сложный путь
познания человеком окружающего органического
мира, истоки которого уходят во времена
античности. В те времена гениальные пророческие
идеи причудливо переплетались с наивными
представлениям об окружающем мире. Так,
например, Аристотель полагал, что живые
существа образуются из сочетания пассивного,
не имеющей жизни, начала - «материи» с
активным началом - «формой», которая формирует
тело и поддерживает в нем жизнь.
В последующем неоплатоники развивая
эти идеи сформулировали понятие о «жизненной
силе», «животворящем духе» и т.д., которые
в различных модификациях существовали
и в средние века. В VII – X веках в Европе
с развитием алхимии стал накапливаться
материал о составе сложных органических
соединений.
Эпоха Возрождения характеризуется динамическим
восприятием окружающего мира, которое
превратило науку из ритуально-магической
в открытую. Наука рассматривала человеческое
тело как сложную механическую машину.
Наш выдающийся современник, английский
философ и историк науки Дж. Бернал так
характеризует ту эпоху: «... врачи свободно
общались с мастерами-художникам , математиками,
астрономами и инженерами. По сути дела,
многие из них занимались некоторыми из
этих профессий. Так, например, Коперник
получил образование и практиковал как
врач...».
Именно это привело науку к новой ступени
- живое стали оценивать химическими категориями.
В XVI - XVII веках получила развитие ятрохимия (врачебная химия),
важнейшим представителем которой был
Парацельс (1493-1541), считавший, что в основе
всех заболеваний лежат нарушения хода
химических процессов в организме, поэтому
лечить их надо тоже химическими веществами.
Ятрохимия много дала практической медицине
и способствовала ее сближению с химией.
Середина ХVII - конец ХVIII вв является эмпирическим
периодом развития органической химии
которая по определению великого шведского
химика Й. Берцелиуса была химией «растительных
и животных веществ». За это время произошло
накопление огромного фактического
материала, но еще не возникло теоретических,
обобщающих представлений. Практические
потребности человеческой деятельности
(получение из природного сырья лекарств,
масел, смол, красителей и т.д.) явились
основной причиной, побуждающей к изучению
органических соединений.
Совершенствование экспериментальных
методов способствовало выделению индивидуальных
органических соединений из растений
(щавелевая, яблочная, лимонная и др. кислоты)
и продуктов жизнедеятельности животных
организмов (мочевина, мочевая и гиппуровая
кислоты).
Следующий период - аналитический (конец
ХVIII - середина ХIХ вв. - ознаменован исследованиями
по установлению состава веществ,
в результате которых стало очевидно,
что все органические соединения содержат
углерод. Вот лишь некоторые достижения
этого периода:
В 1828 г. Ф. Вёлер впервые синтезировал
мочевину, открыв тем самым эпоху органического
синтеза.
В 1839 г Ю. Либих установил, что в состав
пищи входят белки, жиры и углеводы.
В 1845 г. Г. Кольбе синтезировал уксусную
кислоту
В 1854 г М. Бертло синтезировал жиры.
В 1861 г А.М. Бутлеров синтезировал
углеводы.
Подводя итоги развития биохимии в ХIХ
в. отметим, что основными факторами ее
формирования было развитие химии важнейших
природных соединений - липидов, углеводов
и особенно белков, первые успехи энзимологии,
разработка основных положений о многоступенчатости
обмена веществ и роли ферментов в этих
процессах. Биологическая химия того времени
ставила своей главной целью изучение
методами химии не суммарных процессов
обмена веществ, а превращение в организме
каждого отдельного соединения и разработка
представлений о всех деталях обменных
процессов в совокупности.
Наиболее интенсивно биохимия стала
развивать в ХХ веке и особенно в последние
десятилетия. В первой половине ХХ в. были
сделаны важнейшие открытия, которые позволили
построить общую схему обмена веществ,
установить природу ферментов и исследовать
их важнейшие свойства, значительно расширить
знания об основных биологически активных
соединениях. В 40-50-е годы интенсивно развивались
и усовершенствовались методы биохимических
исследований определившие в последующие
десятилетия формирование отдельных направлений
биохимии ставших самостоятельными науками
- биоорганической химии, молекулярной
биологии, молекулярной генетики, биотехнологии
и др.
История развития
отечественной биохимии.
Наши соотечественники внесли большой
вклад в развитие биохимии. Так, первый
в России учебник физиологической химии
издан еще в 1847 г. А.И. Ходневым.
Основоположником отечественной биохимии
является профессор Александр Яковлевич
Данилевский (1839-1923), который в 1863 г. создал
первую кафедру биохимии в Казанском университете,
создал первую русскую школу биохимиков.
Занимаясь исследованием белков, он впервые
постулировал идею пептидной связи в белке,
высказал идеи об обратимости действия
ферментов, на основе чего впервые осуществил
синтез белковоподобных веществ - пластеидов,
разработал методы очистки ферментов
путем адсорбции с последующей элюцией
и т.д.
К числу наиболее значимых достижений
отечественной биохимии следует отнести
открытие в 1880 г. Н.И. Луниным витаминов,
создание А.Н. Бахом в 1896 г. теории биологического
окисления (активирования кислорода),
открытие в 1899г. И.П. Павловым и Н.П. Шеповальниковым
проферментов, разработка метода хроматографии
М.С. Цветом в 1903 г., создание В.И. Палладиным
в 1912 г. теории биологического окисления
(активирования водорода) и др.
Советский этап развития биохимии связан
с именем Алексея Николаевича Баха (1859-1946),
который организовал в 1921 г. в Москве Научно-исследовательс ий
биохимический институт Наркомздрава,
а в 1935 г. он возглавил переведенный из
Ленинграда в Москву Институт биохимии
АН СССР, названный впоследствии его именем
Отечественная наука по праву гордится
пионерскими работами акад. Ю.А. Овчинникова
в области мембранной биологии, акад.
А.С. Спирина по молекулярным механизмам
биосинтеза белка, акад. В.П. Скулачева
по биоэнергетике.
Широко за рубежами нашего отечества
известны работы по биохимии витаминов
белорусской школы биохимиков, возглавляемой
акад. Ю.М. Островским. Большим авторитетом
в стране и за рубежом пользуются работы
украинских биохимиков в области нейрохимии
и биохимии витаминов (акад. А.В. Палладин),
биохимии белкового, липидного обмена,
возрастной биохимии.
Предмет и задачи биохимии. Методы биохимических
исследований.
Биологическая химия решает большое
число задач. Поскольку в основе жизнедеятельности
здорового организма лежит сложнейшая
совокупность биохимических реакций,
то при патологии нормальное течение биохимических
реакций, как правило, нарушается. В связи
с чем возникает необходимость исследовать
состояние обмена веществ не только в
норме, но и при патологии.
Задача врача заключается в том, чтобы
предотвратить развитие патологического
процесса в организме и ее решение возможно
лишь при своевременной и правильной диагностике,
назначении адекватного лечения, которое
возможно лишь в том случае, если врач
понимает сущность происходящего в организме.
При назначении в процессе лечения различных
медикаментов, которые включаются в метаболические
процессы, необходимо четко представлять
механизм их действия и предвидеть возможные
последствия этого лечения.
1. Познание
молекулярных механизмов физиологических,
генетических и иммунологических процессов
жизнедеятельности в норме и при патологии
и действии на организм различных факторов.
2. Совершенствование
методов профилактики, диагностики и лечения
заболеваний.
3. Разработка
новых лекарственных средств, нормализующих
обменные процессы.
4. Разработка
научных основ, рационального, сбалансированного
питания, здорового образа жизни.
5. Разработка
научных основ Исторически сложились
три направления биохимии:
1. Статическая
биохимия - исследует качественные и количественный
химический состав живых организмов.
2. Динамическая
биохимия - изучает совокупность превращений
веществ, энергии и информации в живом
организме.
3. Функциональная
биохимия - изучает химическую основу
функций тканей, органов, систем органов
и межорганных взаимоотношений.
В зависимости от объекта исследования
или направления исследования биохимию
подразделяют на такие разделы как:
- общая биохимия которая изучает общие
вопросы химических основ жизнедеятельности
различных организмов
- бионеорганическая химия изучающая
роль и значение в процессе жизнедеятельности
комплексов неорганических ионов с органическими
соединениями
- биоорганическая химия исследующая
физико-химические основы функционирования
живых систем
- биохимия человека и
животных, (растений, микроорганизмов)
- техническая биохимия, изучающая состав
пищевых продуктов, химическую основу
технологических процессов их хранения,
переработки и т.д.
- сравнительная (эволюционная) биохимия которая
исследует биохимические процессы в сравнительном
(эволюционном) аспекте
- радиационная биохимия изучает биохимические
основы радиационного повреждения и способы
его профилактики в живой организме
- медицинская (клиническая)
биохимия исследует биохимические основы патологических
процессов.
Основные методические подходы
к изучению метаболизма
Метаболизм, или
обмен веществ, — это совокупность процессов поступления
веществ из окружающей среды, их превращений
в организме и выведения из организма
продуктов жизнедеятельности. В результате
обмена веществ в организме сохраняется
постоянство состава клеток и клеточных
структур путем обновления их по мере
необходимости, а также поддерживается
их энергетический баланс. Процессы обмена
веществ в клетках характеризуются высокой
упорядоченностью и строгой последовательностью
идущих в них биохимических реакций, участием
в них различных ферментов и всех клеточных
структур.
Анаболизм — это совокупность
процессов биосинтеза органических веществ,
компонентов клетки и других структур
органов и тканей. Анаболизм обеспечивает
рост, развитие, обновление биологических
структур, а также непрерывный ресинтез
макроэргических соединений и их накопление. Катаболизм — это совокупность процессов
расщепления сложных молекул, компонентов
клеток, органов и тканей до простых веществ
(с использованием части из них в качестве
предшественников биосинтеза) и до конечных
продуктов метаболизма (с образованием
макроэргических и восстановленных соединений).
Взаимосвязь процессов катаболизма и
анаболизма основывается на единстве
биохимических превращений, обеспечивающих
энергией все процессы жизнедеятельности
и постоянное обновление тканей организма.
Сопряжение анаболических и катаболических
процессов в организме могут осуществлять
различные вещества, но главную роль в
этом сопряжении играют АТФ, НАДФ • Н.
В отличие от других посредников метаболических
превращений АТФ циклически рефосфорилируется,
а НАДФ • Н — восстанавливается, что обеспечивает
непрерывность процессов катаболизма
и анаболизма.
1.2
Белки - это главная составная
часть живых организмов и материальная
основа процессов жизнедеятельности.
Они являются высокомолекулярными
природными полимерными соединениями,
построенными из аминокислотных
остатков, соединенных посредством
пептидной связи. В создании белков участвует 20 аминокислот.
Они связываются между собой в длинные
цепи, которые образуют основу белковой
молекулы большой молекулярной массы.
Комбинируя разную последовательность
этих аминокислот, можно создавать бесчисленное
множество белковых молекул. Белки выполняют
важные функции в организме. Можно выделить
следующие функции:
Каталитическая функция. Свыше 2000 ферментов - биологических катализаторов выделено к настоящему времени. Практически все они являются белками. Все химические реакции, лежащие в основе процессов жизнедеятельности, катализируются ферментами.
Сократительная функция. Важным признаком живого является подвижность. В основе ее лежит сократительная функция белков. Это относится не только к мышечным сокращениям, но и изменениям формы клеток, субклеточных частиц.
Структурная функция. Существуют специальные белки, выполняющие структурную функцию, например, главный белок соединительной ткани - коллаген. Структурная функция присуща и белкам, выпоняющим другие функции.
Транспортная функция. Белки обладают исключительными возможностями по специфическому связыванию различных соединений, что позволяет им выполнять транспорт веществ по крови и в пределах клетки.
Защитная функция. Как уже указывалось выше, каждый организм биохимически индивидуален, поэтому в процессе эволюции выработаны механизмы узнавания и связывания "чужих" молекул. Это успешно умеют делать белки (антитела).
Регуляторная функция. Среди молекул-регуляторов важное место занимают и регуляторы белковой природы, например, гормоны гипофиза. Белки участвуют также в регуляции важных констант крови: осмотическое давление, рН и т.д.
Энергетическая функция. Эндогенные (непищевые) белки, точнее, продукты их ферментативного внутриклеточного гидролиза, служат источником энергии только в особых условиях (длительное голодание, интенсивная длительная мышечная работа).
Аминокислоты - главные составные части
белков
Физико-химические
и биологические свойства белков определяются
их аминокислотным составом. Аминокислоты
- это аминопроизводные класса карбоновых
кислот. Аминокислоты входят не только
в состав белков. Многие из них выполняют
специальные функции. Поэтому в живых
организмах различают аминокислоты протеиногенные
(кодируются генетически) и непротеиногенные
(не кодируются генетически). Протеиногенных
аминокислот 20. 19 из них являются a-аминокислотами.
Это означает, что аминогруппа у них присоединена
к a-углеродному атому той карбоновой кислоты,
производным которой они являются. Общая
формула этих аминокислот выглядит следующим
образом:
Только одна
аминокислота - пролин не соответствует
этой общей формуле. Ее относят к иминокислотам.
a-углеродный
атом аминокислот является ассимметричным
(исключение составляет аминопроизводное
уксусной кислоты - глицин). Это означает,
что у каждой аминокислоты имеются, как
минимум, 2 оптически активных антипода,
природные белки построены из L-a- аминокислот.
Классификация
аминокислот проводится по строению их
радикала. Существуют разные подходы к
классификации. Большая часть аминокислот
- это алифатические соединения. 2 аминокислоты
являются представителями ароматического
ряда и 2 - гетероциклического.
Аминокислоты
можно разделить, по их свойствам, на основные,
нейтральные и кислые. Они отличаются
числом амино- и карбоксильных групп в
молекуле. Нейтральные - содержат по одной
амино- и одной карбоксильной группе (моноаминомонокарбон вые).
Кислые имеют 2 карбоксильные и одну аминогруппу
(моноаминодикарбоно ые), основные -2 аминогруппы
и одну карбоксильную (диаминомонокарбонов е).
1.
Собственно алифатическими можно
назвать 5 аминокислот. Глицин или гликокол (Гли),
Является единственной
оптически неактивной аминокислотой.
Глицин используется не только для синтеза
белков. Его атомы входят в состав нуклеотидов,
гема, он входит в состав важного трипептида
- глутатиона.
Аланин (Ала),
нередко используется в организме для
синтеза глюкозы.
Валин (Вал),.
Лейцин (Лей, L) Изолейцин (Иле, I). Эти три
аминокислоты, обладая выраженными гидрофобными
свойствами, играют важную роль в формировании
пространственной структуры белковой
молекулы.
2.
Гидроксиаминокислот . Серин (Сер, S) и треонин (Тре, T) играют
важную роль в процессах ковалентной модификации
структуры белков. Их гидроксильная группа
легко взаимодействует с фосфорной кислотой,
что бывает необходимым для изменения
функциональной активности белков.
3. Серусодержащие аминокислоты.
Цистеин (Цис, C) Специальным свойством
цистеина является способность к окислению
(в присутствии кислорода) и взаимодействию
с другой молекулой цистеина с образованием
дисульфидной связи и нового соединения
- цистина. Эта аминокислота благодаря
активной -SH группе легко вступает в окислительно-восстано ительные
реакции, защищая клетку от действия окислителей,
участвует в образовании дисульфидных
мостиков, стабилизирующих структуру
белков, входит в состав активного центра
ферментов.
Метионин
(Мет, M). Выполняет функцию донора подвижной
метильной группы, необходимой для синтеза
биологически активных соединений: холина,
нуклеотидов и т.д. Это гидрофобная аминокислота.
4.
Дикарбоновые аминокислоты. Глутаминовая (Глу, E) и аспарагиновая
кислота (Асп, D). Это наиболее распространенные
аминокислоты белков животных организмов.
Эти аминокислоты способствуют ионному
взаимодействию, придают заряд белковой
молекуле. Эти аминокислоты могут образовывать
амиды.
5.
Амиды дикарбоновых аминокислот. Глутамин (Глн,
Q) и аспарагин (Асн, N). Эти аминокислоты
выполняют важную функцию в обезвреживании
и транспорте аммиака в организме. Амидная
связь в их составе частично имеет характер
двойной. За счет этого амидная группа
обладает частичным положительным зарядом
и не будет диссоциировать.
6. Циклические аминокислоты
Фенилаланин (Фен, F) Тирозин (Тир, Y). Эти
2 аминокислоты образуют взаимосвязанную
пару, выполняющую важные функции в организме,
среди которых следует отметить использование
их клетками для синтеза ряда биологически
активных веществ (адреналина, тироксина).
Триптофан
(Три, W). Используется для синтеза витамина
PP, серотонина, гормонов эпифиза.
Гистидин
(Гис, H). Может использоваться при образовании
гистамина, регулирующего проницаемость
тканей и проявляющего свое действие при
аллергии.
7. Диаминомонокарбоновы аминокислоты.
Лизин (Лиз, K) Аргинин (Арг, R). Эти аминокислоты
имеют дополнительную аминогруппу, которая
придает основные свойства белкам, содержащим
много таких аминокислот. Образование
аргинина является частью метаболического
пути обезвреживания аммиака (синтез мочевины).
Свойства аминокислот - основа свойств
белков
Свойства аминокислот - основа свойств
белков
Химические
и физико-химические свойства аминокислот
обусловлены тем, что они имеют радикал
и 2 функциональные группы с противоположными
свойствами: кислую карбоксильную и основную
аминогруппу. Поэтому в водном растворе
аминокислоты существуют в виде равновесной
смеси биполярного иона, катионной и анионной
форм молекулы. Равновесие зависит
от pH среды.
Нейтральные
аминокислоты в воде не имеют заряда. Иначе
ведут себя дикарбоновые аминокислоты.
Обе их карбоксильные группы диссоциируют,
отдавая 2 протона, но поскольку у них только
одна аминогруппа, принимающая один протон,
то такие аминокислоты ведут себя как
кислоты, и раствор их имеет кислую реакцию.
Возникающий при этой диссоциации ион
имеет избыток отрицательного заряда.
Основные
аминокислоты реагируют в водном растворе
как слабые основания. Это связано с тем,
что один протон, который освобождается
при диссоциации карбоксильной группы
таких аминокислот, связывается с одной
из аминогрупп, а вторая аминогруппа связывает
протон из водного окружения, увеличивая
тем самым количество OH групп и повышая
pH. Заряд иона таких аминокислот будет
положительным.
При добавлении
в раствор аминокислот дополнительного
количества протонов (кислоты) подавляется
диссоциация карбоксильных групп и увеличивается
количество NH3+ групп. Аминокислоты при этом переходят
в катионную форму (приобретают положительный
заряд). При добавлении щелочи, наоборот,
улучшаются условия для диссоциации карбоксильных
групп. Аминокислоты переходят в анионную
форму (приобретают отрицательный заряд).
Изменяя, таким образом, pH раствора, можно
изменять заряд молекул аминокислот (рис.1.1).
Рис.1.1. Кривые,
полученные в результате титрования раствора
глицина
В зависимости
от свойств аминокислот количество добавляемой
кислоты или щелочи для изменения величины
заряда будет разным. При определенном
для каждой аминокислоты значении pH наступает
такое состояние, при котором заряд аминокислоты
становится нейтральным. Такое значение
pH получило название изоэлектрической точки (ИЭТ).
При значении pH, равном изоэлектрической
точке, аминокислоты не перемещаются в
электрическом поле.
Спектроскопические
свойства аминокислот
1) все
аминокислоты поглощают свет
в инфракрасной области спектра;
2) три циклических аминокислоты
- фенилаланин, тирозин и триптофан поглощают
свет в ультрафиолетовой области (рис.1.2).
Это свойство широко используется для
аналитического определения белков;
3) ядерный
магнитный резонанс (ЯМР). Каждая
аминокислотный остаток в составе
белка имеет характерный спектр
ЯМР. Высокая разрешающая способность
этого метода используется для
выяснения пространственной структурной
организации белков (рис.1.3).
Рис. 1.3. ЯМР
спектры аминокислот
1.3 В пространственой
структуре белков выделяют четыре уровня
организации
Белки -
высокомолекулярные полимерные соединения
с довольно сложной пространственной
структурой. Попытки разобраться в их
структурной организации заставили исследователей
выделить в структуре белков несколько
уровней.
Первичной структурой белка является конфигурация полипептидной
цепи (последовательность аминокислот
и локализация дисульфидных мостиков).
Рис. 1.11. Первичная структура
белковой молекулы
Основной тип
связи этого уровня - ковалентная пептидная
связь. Основу цепи составляет повторяющаяся
последовательность -CO-CH-NH-. Характерные
для каждой аминокислоты радикалы расположены
вне цепи. Именно эти радикалы и несут
главную нагрузку при выполнении функций
белками.
1.3.1Исследование
первичной структуры белков и пептидов
Можно выделить
следующие этапы выяснения первичной
структуры белков и пептидов:
Выделение
белка в чистом виде и определение
его молекулярной массы
Определение
аминокислотного состава
Определение N-концевой аминокислоты
Определение С-концевой аминокислоты
Определение аминокислотной последовательности
Определение аминокислотного состава
белка. До определения аминокислотной последовательности
выделенного белка желательно иметь представление
о его аминокислотном составе, то есть
знать, какие аминокислоты и в каком количестве
входят в состав его молекулы. Для этого
проводят полный гидролиз белка с последующим
количественным анализом высвободившихся
аминокислот. Чаще используют кислотный
гидролиз. Полипептид растворяют в 6N НCl
в отсутствие кислорода, чтобы предотвратить
окисление серусодержащих аминокислот.
Смесь нагревают до 100-1200С и выдерживают при этой температуре
в течение 10-100ч. К сожалению при этом способе
гидролиза некоторые аминокислоты (Сер,
Три, Тир, Глн, Асн) разрушаются.
Аминокислотный
состав полипептидного гидролизата определяют
с помощью автоматического аминокислотного
анализатора. Прибор разделяет аминокислоты
посредством ионообменной хроматографии.
Их идентифицируют по элюционному объему
и количественно учитывают по интенсивности
флюоресценции после проведения реакции
с дансилхлоридом.
1.3.1 Определение N-концевой аминокислоты.
Популярным
методом идентификации N-концевой аминокислоты
является разрушение по Эдману (Pehr
Edman - автор метода). Фенилизотиоцианат
(ФИТЦ, реактив Эдмана) взаимодействует
с N-концевой аминогруппой белков в слабо
щелочной среде (рис.1.18). В результате образуется
фенилтиокарбамильны продукт. Его обрабатывают
безводной сильной кислотой, такой как
трифторуксусная кислота. При этом тиазолиновое
производное N-концевой аминокислоты отщепляется,
в то время как остальные пептидные связи
не подвергаются гидролизу. Тем самым
разрушение по Эдману заключается в отщеплении
остатка только N-концевой аминокислоты
и сохранении оставшейся части полипептидной
цепи.
Тиазолиновое
производное аминокислоты избирательно
экстрагируют органическим растворителем
и превращают в более стабильное фенилтиогидантоиново
производное. Последнее можно идентифицировать
сравнением с известными стандартами
при проведении тонкослойной хроматографии,
электрофореза, высокоэффективной жидкостной
хроматографии или газо-жидкостной хроматографии.Наиболе
важным преимуществом расщепления по
Эдману по сравнению с другими методами
определения N-концевой аминокислоты является
то, что, проводя повторно с одним и тем
же пептидом эту процедуру, каждый раз
можно идентифицировать новую N-концевую
фенилгидантоин-амин кислоту, выясняя
таким образом аминокислотную последовательность.
1.3.2Идентификация С-концевой аминокислоты. Один из подходов
заключается в использовании ферментов
- карбоксипептидаз (катализирует отщепление
от пептида С-концевой аминокислоты). Карбоксипептидазы,
подобно другим ферментам, обладают субстратной
специфичностью, то есть они катализируют
отщепление определенных аминокислот.
Вместе с тем, наличие рядом с С-концевой
аминокислотой остатка Про делает невозможной
её отщепление под влиянием карбоксипептидазы.
В этом случае наиболее надежным считается
метод гидразинолиза. Полипептид обрабатывают
безводным гидразином при температуре
900С в течение 20-100ч в присутствии ионообменного
сорбента (в качестве катализатора). При
этом разрушаются все пептидные связи,
а из высвобождающихся аминокислот образуются
гидразиды. Но С-концевая аминокислота
высвобождается как свободная и поэтому
её можно идентифицировать хроматографически.
1.3.3 Определение аминокислотной последовательности.
Установление
концевых аминокислот в исследуемом пептиде
позволяет в дальнейшем определить всю
его аминокислотную последовательность.
Для этого обычно проводят повторное разрушение
по Эдману в автоматическом приборе - секвенаторе,
который был предложен П. Эдманом и Г. Бэгом.
Современный такой прибор определяет
1 аминокислотный остаток в час. Таким
способом можно установить последовательность
расположения 40-60 остатков аминокислот.
Затем накапливаются незавершенные реакции,
продукты побочных реакций. Наряду с потерей
самого пептида они делают малоинформативной
и ненадежной дальнейшую идентификацию
аминокислот. Чтобы установить последовательность
их расположения в больших полипептидных
молекулах, их подвергают расщеплению
ферментативным или химическим путем
на фрагменты с размерами, достаточными
для проведения секвенирования (рис.1.19).
1.3.4 Исследование последовательности
нуклеотидов ДНК - рутинная операция в
молекулярной биологии. Этот метод в последнее время вытеснил
другие методы исследования первичной
структуры белков. Зная последовательность
нуклеотидов, можно легко установить последовательность
аминокислот
Метод пептидных карт. Процесс определения аминокислотной
последовательности в белке - процедура
достаточно длительная. Её можно существенно
ускорить в случае выяснения аминокислотной
последовательности гомологичного белка,
если у сравниваемого белка она уже известна.
Метод носит название "метод пептидных
карт" или "метод отпечатков пальцев".
Он включает в себя сочетание хроматографии
и электрофореза на бумаге продуктов неполного
гидролиза сравниваемых белков. При этом
пептидные фрагменты, отличающиеся аминокислотной
последовательностью будут обладать
разной подвижностью по сравнению с таковыми
у исходного белка
1.4 Пространственная структура белковой
молекулы
Самым лучшим
методом, позволяющим выяснить расположение
в трехмерном пространстве белковой молекулы,
является рентгеноструктурный анализ
кристаллов белка. Белок для этого должен
быть очень чистым (гомогенным). Из него
готовится насыщенный раствор (около 10
мг белка/мл), который выдерживается до
образования в нем кристаллов. В кристалле
белковые молекулы формируют очень правильную
решетку. Такой кристалл помещают на пути
пучка g-лучей. g-частицы, проходя через кристаллическую
решетку, сталкиваются с атомами молекулы
белка и изменяют свою траекторию. В результате
возникает вторичное g-излучение, которое фиксируется на фотопластинке.
Кристалл белка поворачивают на определенный
угол и снова пропускают через него g-лучи.
На фотопластинках с дифракционными картинами
вторичного g-излучения измеряется расстояние между
пятнами, а с помощью компьютера формируют
карту электронной плотности. Затем специальным
математическим методом, получившим название
"трансформация Фурье", карту преобразуют
в структурную модель белка.
Именно
таким методом пользовались американские
исследователи Л. Поллинг и Р. Кори, исследуя
ди- и трипептиды. Из обнаруженных особенностей
в строении пептидной связи вытекали три
постулата или принципа, сформулированные
Л.Поллингом и Р.Кори:
Атомы, образующие пептидную связь, копланарны (лежат в одной плоскости). Вращение атомов или групп атомов вокруг пептидной связи невозможно или чрезвычайно затруднено;
Принцип эвивалентности вклада аминокислотных остатков в образование пептидной связи и, тем самым, в образование полипептидной цепи (за исключением Про).
3. Принцип
максимума водородных связей. В
белках атомы водорода и кислорода
практически всегда располагаются
в транс-конформации. Это обусловливает
возможность образования в полипептидной
цепи максимума водородных связей Если
пептидные связи "жесткие", плоскостные,
то участки полипептидной цепи между Сa - С
и N - Сa конформационно подвижны. В результате
стремления боковых радикалов аминокислотных
остатков выйти из заслонения формируется
правозакрученная спиралевидная конформация
полипептидной цепи
Вторичная структура
белков
В 1950 г. Лайнус Полинг предложил два вида
пространственной структуры белков - альфа-спираль
и бета-структуру. Эти понятия сохранились
до настоящего времени как виды вторичной
структуры белков. Кроме них сейчас различают
ещё один, третий тип вторичной структуры
- b-поворот. Вторичная структура белка
- это локальная конформация полипептидной
цепи, обусловленная вращением отдельных
участков этой полипептидной цепи вокруг
одинарных ковалентных связей.
Стабильность спирали поддерживают водородные
связи между атомами пептидных группировок
аминокислот, расположенных на соседних
витках спирали. Все условия, ведущие к
формированию спиральных структур, мог и т.д.................
