На бирже курсовых и дипломных проектов можно найти образцы готовых работ или получить помощь в написании уникальных курсовых работ, дипломов, лабораторных работ, контрольных работ, диссертаций, рефератов. Так же вы мажете самостоятельно повысить уникальность своей работы для прохождения проверки на плагиат всего за несколько минут.

ЛИЧНЫЙ КАБИНЕТ 

 

Здравствуйте гость!

 

Логин:

Пароль:

 

Запомнить

 

 

Забыли пароль? Регистрация

Повышение уникальности

Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp», которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение уникальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения уникальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии и при повышении уникальности не вставляет в текст скрытых символов, и даже если препод скопирует текст в блокнот – не увидит ни каких отличий от текста в Word файле.

Результат поиска


Наименование:


Диплом Нейтрофилы и продукты их секреции принадлежат к числу центральных участков воспаления. Нейтрофилы человека экспресируют широкий набор белков синтаксина и установлена внутриклеточная локализация для двух представителей этого семейства: синтаксина 4 и 6.

Информация:

Тип работы: Диплом. Предмет: Медицина. Добавлен: 01.01.2009. Сдан: 2009. Уникальность по antiplagiat.ru: --.

Описание (план):


42
Министерство общего и профессионального образования Российской Федерации
Мордовский ордена дружбы народов государственный университет
имени Н.П. Огарева
Факультет биологический
Кафедра генетики
Утверждаю
Зав. кафедрой
д.б.н., профессор Трофимов В.А..
«___»____________2001 г.
Дипломная работа
тема: Изучение взаимодействия синтаксина 6 с мембранными белками секреторных гранул нейтрофилов человека

Автор дипломной работы: Сальникова Е.Н.
Обозначение дипломной работы: ДР-2069965-011600-14-01 группа 501
Специальность: 011600
Руководитель работы: д.б.н., профессор Набокина С.М.
Нормоконтролер: к.б.н., доцент Мышляков Г.М.
Рецензент: д.б.н., профессор Шубина О.С.
Саранск 2001
МОРДОВСКИЙ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.П. ОГАРЕВА
факультет иностранных языков
кафедра английского языка
Утверждаю
Зав.кафедрой
д.б.н., профессор Трофимов В.А.
«____»___________ 2001
ЗАДАНИЕ НА ДИПЛОМНУЮ РАБОТУ
Студентка Сальникова Елена Николаевна группа 501
Тема: Изучение взаимодействия синтаксина 6 с мембранными белками секреторных гранул нейтрофилов человека.
Срок представления работы к защите: 20.06.2001 г.
Исходные данные для дипломной работы: литературные материалы, публикации в периодической печати.
Содержание дипломной работы:
Список использованных сокращений
Введение
Обзор литературы
Характеристика основных белковых компонентов модели
Методы
Полученные результаты и их обсуждения
Выводы
Список использованных источников
Руководитель работы: ________________________С.М. Набокина
подпись, дата д.б.н., профессор
Задание принял к исполнению: __________________Е.Н. Сальникова
подпись, дата
Реферат

Дипломная работа содержит 44 страницы машинописного текста, 5 рисунков, 2 таблицы, 48 использованных источников, из них - 40 иностранной литературы.
Перечень ключевых слов: нейтрофилы, экзоцитоз, взаимодействие белков, snare, vamp-1, синтаксин 6, snap-25, snap-23.
Объекты исследования: нейтрофилы периферической крови человека.
Цель работы: изучение взаимодействия белок-белковых взаимодействий между синтаксином 6 и другими белками группы snare in vivo.
Методы исследования: выделение из нейтрофилов человека snare комплексов при помощи иммунопреципитации на моноспецифических антителах против синтаксина 6, присоединенных к протеину а-агарозе и их харакетристика.
Полученные результаты: выявлены взаимодействия синтаксина 6 с vamp-1, snap-23 и snap-25.
Список использованных сокращений

БЛМ - бислойные липидные мембраны
ПМЯ - полиморфно-ядерные лейкоциты
SNAP - белок цитозоля, связывающийся с NSF
NSF - фактор, чувствительный к N-этилмалеимиду
SNARE - рецептор для SNAP
SNAP-25 - белок с молекулярной массой 25 кДа, ассоциированный с синаптосомами
SNAP-23 - белок с молекулярной массой 23 кДа, ассоциированный с синаптосомами
VAMP - мембранный белок, ассоциированный с везикулами
МПО - миелопероксидаза
ФМА - 4бетта-форбол 12-миристат 13-ацетат
ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид
ДДС-Na - додецилсульфат натрия
ПААГ - полиакриламидный гель
ТЕМЕД - N, N, N, N - тетраметилэтилендиамин.
Содержание

Список использованных сокращений
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Общая характеристика нейтрофилов человека
1.2. Внутриклеточные гранулы нейтрофилов человека
1.3. Современные представления о механизмах слипания/слияния мембран
2. Характеристика основных белковых компонентов модели
2.1. VAMP/ синаптобревин
2.2. Синтаксины
2.3. SNAP-25
2.4. NSF
2.5. SNAP
2.6. Механизм слипания/ слияния мембран
3. Методы
3.1. Объекты исследования
3.2. Выделение нейтрофилов человека
3.3. Электрофорез белков
3.4. Иммуноблоттинг
3.4.1. Перенос фракций из геля на фильтр
3.4.2. Иммунное выявление антигенов на фильтре
3.4.3. Активация нейтрофилов
3.4.4. Иммунопреципитация
4. Полученные результаты и их обсуждение
Выводы
Список использованной литературы
Введение

Нейтрофилы и продукты их секреции принадлежат к числу центральных участков воспаления. Они играют ключевую роль в защите организма, поглощая и разрушая чужеродные клетки и бактерии. Нейтрофилы человека содержат четыре типа гранул: азурофильные, специфические, желатиназные гранулы, а также везикулы которые в разной степени способны претерпевать экзоцитоз в ответ на повышение внутриклеточной концентрации ионов Са+.
В настоящее время для объяснения молекулярного механизма экзоцитоза в нейтрофилах используется SNARE гипотеза. Эта модель основана на взаимодействии белков мембраны секреторной везикулы и белков плазматической мембраны с последующим связыванием цитозольных белков, приводящая к слиянию мембран. Группу SNARE составляют белки, относящиеся к семействам:
семейство VAMP (Vesicle - Associated Membrane Protein),
семейство SNAP-25 (Synaptosome - Associated Protein of 25 кДа),
семейство синтаксинов.
В настоящее время в нейтрофилах человека идентифицированы множественные изоформы SNARE белков.
Обнаружено, что нейтрофилы человека экспресируют широкий набор белков семейства синтаксинов и установлена внутриклеточная локализация для двух представителей этого семейства: синтаксина 4 и 6. В последние годы в литературе появились сведения о взаимодействии синтаксина 4 с VAMP-2, SNAP-25 и SNAP-23. Что касается белка синтаксина 6, то в настоящее время взаимодействия этого белка с другими белками группы SNARE, не изучены. Поэтому целью данной дипломной работы явилось изучение белок-белковых взаимодействий между синтаксином 6 и другими белками группы SNARE in vitro, т.е. в интактных клетках.
1. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика нейтрофилов человека

Нейтрофилы (полиморфно-ядерные лейкоциты, ПМЯ) и продукты их секреции принадлежат к числу центральных участков воспаления. Они играют ключевую роль в защите организма, поглощая и разрушая чужеродные клетки и бактерии [3].
Нейтрофилы имеют ряд характерных черт. Это присутствующие в большом количестве подвижные, короткоживущие клетки, способные к хемотаксису и фагоцитозу [1]. Общий вес нейтрофилов у одного человека составляет 1,5 кг [6. Эти клетки являются источником медиаторов воспаления, включая цитокины, и токсичных продуктов, таких как радикалы кислорода и гидролазы. В норме лизосомные ферменты и окислительные агенты нейтрофилов, продуцированные при запуске фагоцитоза, осуществляют внутриклеточный катаболизм белков и других макромолекул, деградацию фагоцитированных вирусов и бактерий. В норме нейтрофилы находятся в неактивном, спокойном состоянии.
При патологических состояниях функции этих клеток усиливаются. При этом происходит интенсивное генерирование и высвобождение медиаторов воспаления в межклеточное пространство. Инициация каскадных протеолитических реакций и продукция биологически активных пептидов, связанно с этими процессами, приводят к развитию воспаления [7].
1.2. Внутриклеточные гранулы нейтрофилов человека

Нейтрофилы человека содержат четыре типа гранул: азурофильные, специфические, секреторные везикулы и желатиназные. Последние два типа были обнаружены в последние 10 - 15 лет с помощью субклеточного фракционирования и иммуно-электронной микроскопии. Гранулы, принадлежащие к разным типам, отличаются размером, морфологией, составом и способностью к мобилизации. Классификация азурофильных и специфических гранул основывалась на сродстве гранул к основному красителю азуровому А, содержании в гранулах миелопероксидазы и очередности появления гранул в ходе миелопоеза.
Желатиназные гранулы, формируемые на стадии палочкоядерных клеток, мобилизуются более быстро, чем специфические гранулы, образуемые на стадии миелоцитов и метамиелоцитов, а специфические гранулы, в свою очередь, мобилизуются более быстро, чем азурофильные гранулы, появляющиеся на стадии промиелоцитов.
Гранулы ПМЯ содержат большое количество различных ферментов, а именно протеолитические ферменты являются наиболее деструктивными [1].
Таблица 1.1.
Субклеточная локализация белков и ферментов в ПМЯ (Белова, 1997).
Класс
Азурофильные гранулы
Специфические гранулы
Бактерицидные ферменты
Миелопероксидаза
Лизоцим
Лизоцим
Протеиназы
Эластаза
Катепсин G
Протеиназа З
Катепсин В
Катепсин Д
Коллагеназа
Другие гидролазы
N-Ацетил--глюкозаминидаза
-глюкоуронидаза
-глицерофосфатаза
-маннозидаза
Сульфатазы
Нуклеазы
Щелочная фосфотаза
Другие белки
Лактоферрин
Белки, связывающие витамин В12 2-микроглобулин
Ферменты нейтрофилов, действуя совместно, могут разрушать эластин, коллаген и различные другие белки, активировать комплемент, образовывать кинины из различных кининогенов, а также повышать проницаемость сосудов [8].
В азурофильных гранулах нейтрофилов и моноцитов содержится также миелопероксидаза (МПО) - гемопротеин с молекулярной массой 150 кДа; этот фермент катализирует окисление ионов гамедов (в особенности J-) до гипогаметов [3]. В сочетании с Н2О2 и гамедами, особенно иодидом и бромидом, МПО токсична для различных клеток, в том числе для микроорганизмов, опухолевых клеток, нормальных эритроцитов, тромбоцитов и других лейкоцитов. Хотя фагоцитирующие клетки обычно продуцируют пероксид водорода (Н2О2), бактерии, не продуцирующие каталазы, способны вырабатывать достаточное количество Н2О2 для собственного разрушения [8]. Продукты окисления системы МПО могут также вызывать высвобождение васоактивных аминов из тромбоцитов и тучных клеток [6]. МПО обладает рядом других функций, например она инактивирует окисление хемотаксических олигопентидов, содержащих метионин [39]. Специфические гранулы нейтрофилов содержат лактоферрин - белок с молекулярной массой 90 кДа, в котором имеется два участка, связывания железа. Этот белок высвобождается во внеклеточное пространство вместе с другими ферментами гранул [2]. Железо, связанное с лактоферрином, может играть определенную роль в генерации ОН из О2 и Н2О2.
Другим важным ферментом нейтрофилов, играющим, по-видимому, определенную роль в развитии устойчивости к бактериальной инфекции, является лизоцим. Лизоцимы - это ферменты, растворяющие различные гликозидные связи между N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой, что ведет к лизису клеточных стенок микроорганизмов, а также и к существенному воздействию на мембраны клеток млекопитающих [22].
Учитывая содержимое гранул обоих типов, можно заметить, что набор этих ферментов достаточен для деградации многих или всех липидов, полисахаридов и белков чувствительных бактерий, часто приводящей к деструкции. Эти ферменты могут действовать как внутри клетки, так и вне ее. Если фермент функционирует внутри клетки, частица, доставляется в клетки фагосомой. При продвижении содержащей частицы фагосомы внутрь клетки она сливается с азурофильными и специфическими гранулами и образует фаголизосому; при этом частица, содержащаяся в фагосоме подвергается действию ферментов и других веществ, находившихся в гранулах. Гранулы формируются в аппарате Гольджи на промежуточной стадии развития в костном мозге. Слияние фагосом со специфическими гранулами происходит через 30 с после начала фагоцитоза, тогда как слияние с азурофильными гранулами через 1-3 мин. [1].
Многие из ферментов специфических гранул наиболее активны при нейтральном или щелочном рН, тогда как большинство ферментов азурофильных гранул наиболее активны при кислых значениях рН.
Высвобождение из клетки гранулярных ферментов легче всего наблюдать при усиленном фагоцитозе, когда вновь фагоцитируемые частицы попадают в уже сформированную фаголизосому [2]. Изучение высвобождения содержимого гранул в среду часто проводят в присутствии цитохалазина В; нейтрофилы превращаются в клетки с низкой фагоцитирующей активностью, легко высвобождающие продукты гранул в среду. Высвобождение гранулярных ферментов можно наблюдать и без цитохалазина В - под влиянием самых различных частиц. К числу наиболее эффективных стимулов относятся содержащие молекулы JgG крупные комплексы антигена с антителом [1]. Высвобождение ферментов из специфических гранул происходит в целом с большей интенсивностью чем у азурофильных гранул. Большинство стимулов вызывает одинаковое высвобождение ферментов из специфических и азурофильных гранул, среди них есть и такие, которые индуцируют специфические гранулы, например Кон А, ФМА.
Ферменты нейтрофилов способны функционировать как внутри клетки при фагоцитозе, так и вне клетки при экзоцитозе.
Гранулы нейтрофилов являются источником важных мембранных белков - рецепторов, антигенов, ферментов. В ходе экзоцитоза эти белки встраиваются в плазматическую мембрану нейтрофила и значительно изменяют способность клетки к взаимодействию с ее окружением.
1.3. Современные представления о механизмах слипания/слияния мембран

Слипание и слияние мембран - универсальный и нормальный процесс, важная стадия гетерологического и гомологического межмембранного взаимодействия в ходе экзоцитоза; в ходе аутоиммуных реакций (например, при слиянии макрофагов с лимфоцитами).
Механизмы слияния клеточных и модельных (искусственных) мембран включает в себя одни и те же стадии, что указывает на универсальный механизм взаимодействия мембран. Эти же механизмы распространяются и на слияние мембран внутриклеточных органелл, везикул с плазмалеммой, где важно учитывать специфические подготовительные стадии, ведущие к слиянию. Механизмы слияния в системах клетка-клетка, клетка-везикула (чаще всего секреторные гранулы), везикула-везикула, везикула-плазмалемма, везикула-плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ), БЛМ-БЛМ. Слияние, вероятно, происходит только в специфических участках липидного бислоя мембран. Основной эндогенный фактор слияния - ионы Са - резко снижает гидротационный барьер при слиянии мембран. Кроме того, ионы Са снижают (или нейтрализуют) отрицательный поверхностный заряд, непосредственно модифицируют структуру липидного бислоя, вызывают разделение липидов в бислоях, дестабилизируя их; создают кальциевые мостики между двумя контактирующими мембранами, индуцируя слияние.
Полярные амфидильные молекулы (ненасыщенные жирные кислоты, моноацилглицерин), поликатионы (полилизин), углеводороды (декан), продукты перекисного окисления липидов, диметилсульфоксид, являются индукторами слияния. Процессы слияния предваряются агрегацией везикул, слипанием (адгезией) мембран. Процессам слияния сопутствуют высвобождение содержимого везикул в наружный раствор.
Сам акт слияния включает несколько стадий: частичное (полуслияние и полное слияние, сопровождающееся на последних этапах стабилизацией переходных структур, появлением особых кохлеарных внутримембранных частиц и самое главное, объединением внутренних объемов клеток или везикул. Снижение плотности поверхностного заряда, увеличение ионной концентрации среды, снижение рН среды и введение поликатионов способствует сближению и контакту мембран. Повышение вязкости среды мешает сближению, но облегчает образование контакта уже сближенных мембран. Деформация клеточной поверхности - важный фактор слипания и слияния мембран.
Плотный контакт обеих мембран сначала приводит к образованию пенталаминарной, а затем триламинарной структуры (диафрагмы). Последняя образуется после постепенного вытеснения двух лишних слоев мембран на периферию области контакта. Триламинарная структура - это новый одинарный бислой в зоне контакта, образованный из двух сблизившихся и контактирующих бислоев. Образование триламинарной структуры - универсальный процесс межмембранного взаимодействия.
Добавление ионов Са в малой концентрации в суспензию мембранных везикул вызывает агрегацию, но не слияние последних. При достижении пороговой концентрации Са2+ происходит изотермический фазовый переход фосфолипидов из жидкого состояния в кристаллическое и индуцируется слияние. Ионы Mg повышают температуру фазового перехода фосфолипидов в меньшей степени, чем Са2+. Отсюда следует, что когда Са2+ вызывает слияние везикул, фосфолипиды в присутствии Mg2+ остаются в жидком состоянии и наблюдается агрегация везикул. Это указывает на то, что дестабилизация бислоев при слиянии обусловлена образованием кластеров твердых липидов в жидком бислое.
Структурные перестройки и образование триламинарной структуры могут происходить двумя путями: локально, в зоне «точечного» контакта, в этом случае образуется сталк (перемычка); в зоне плотного дегидратированного контакта (адгезия) на значительной площади мембраны.
Сталкерный механизм предусматривает, что в зоне точечного контакта присутствуют ассиметричные молекулы липидов, участки нестабильности. При контакте эти молекулы хаотически двигаются до тех, пока не образуется триламинарная структура. Адгезионный механизм предусматривает образование в зоне контакта обратных мицелл, сходных гексагональной фазе, в зоне контакта нарушается устойчивость плоской упаковки монослоев, последние преобразуются на обратные мицеллы.
В нормальных условиях слипание и слияние клеток происходит сравнительно редко (в зависимости от функционального состояния клеток). По-видимому, мембранные компоненты различных гранул ответственны за селективную дегрануляцию.
В то время как в нейтрофилах механизмы экзоцитоза не ясны, в нейрональных и дрожжевых клетках механизмы и белковый аппарат секреции изучены довольно детально. Модели слияния мембран, получившей название SNARE гипотеза. Эта гипотеза, впервые предложенная для экзоцитоза синаптических пузырьков, по-видимому ,носит универсальный характер и справедлива как для конститутивного, так и регулируемого слияния мембран.
SNARE гипотеза основана на взаимодействии цитозольных белков NSF (N - ethylmaleimide-sensitive factor) и SNAP (soluble NSF attachment protein) с их рецепторами, названными SNARE (от сочетания английских слов SNAP RECEPTOR). Под термином SNARE традиционно объединяют три группы белков: синтаксисы, синаптобровины/ VAMP (vesicle - associated membrane protein) и SNAP-25 (synaptosome - associated protein of 25 кДа) [45]. Ниже представлена характеристика SNAP, NSF и SNARE, после чего рассмотрен механизм слияния мембран с участием этих белков.
2. Характеристика основных белковых компонентов модели
2.1. VAMP/ синаптобревин

Семейство VAMP/ синаптобревинов объединяет интегральные мембранные белки с молекулярной массой порядка 18 кДа. Два представителя этого семейства VAMP-1 (синаптобревин 1) и VAMP-2 (синаптобревин 2) впервые были обнаружены и охарактеризованы в везикулах нейтральных клеток [9]. Белки представляют собой продукты двух отдельных генов, экспрессия которых различным образом регулируется в нейронах [30]. В настоящее время ненейрональные гомологи VAMP-1 и VAMP-2 идентифицированы в самых разных эукариотических клетках [13]. Одна из изоформ VAMP, а именно VAMP-3/ селлюбревин, характерна только для ненейрональных клеток [35].
В молекулярной структуре белков этого семейства можно выделить NН2 - концевой район, обогащенный остатками промена (аспарагина), гидрофильный центральный участок - «кор»-протяженностью в 70 аминокислотных остатков и СООН - концевой мембранный домен. В некоторых белках, в частности VAMP из Aplysia Californica и Drosophila melanogaster, на С-конце молекулы присутствует небольшой домен, обращенный в полость везикулы [20]. Гидрофильный «кор» является довольно консервативным и незначительно меняется при переходе от одной изоформы к другой. Напротив, в пределах N-концевого района сконцентрированы аминокислотные домены, отличающие белки этого семейства.
VAMP/ синаптобревинам свойственна мембранная топология и ассоциация с мембранами секреторных везикул. В этой связи белки были названы V-SNARE (от английского слова vesicle - везикула). Для некоторых новых изоформ VAMP обнаружен необычный образец внутриклеточной локализации белка. Так, в частности, VAMP-5 связан с плазматической мембраной миобластов, VAMP-1А идентифицирован в плазмалемме, а VAMP-1В в митохондриях клеток эндотелия [28].
Во многих клетках, способных как конститутивной, так и регулируемой секреции, обнаружены белки, гомологичные VAMP.
Комбинация методов субклеточного фракционирования и иммуноцитохимических методов позволила установить наличие VAMP-иммунореакцивных белков в гранулах различных клеток с регулируемым типом секреции. Так, в частности, эти белки идентифицированы в адипоцитах [19], зимогеновых гранулах ацинарных клеток поджелудочной железы крысы [17, инсулин-содержащих гранулах -клеток островков Лангерланса поджелудочной железы крысы, специфических гранулах нейтрофилов человека [16], тубувезикулах пристеночных клеток желудка [18], акросомальных везикулах сперматозоидов и кортикальных гранулах яйцеклеток [21] морского ежа. Для гомологов VAMP-2 прослеживается более широкий образец распространения в указанных клетках, чем для другой белковой изоформы - VAMP-1.
VAMP-3/ селлюбревин был обнаружен во всех исследованных клетках и тканях крысы, что указывает на вовлечение этого белка в процессы конститутивного транспорта везикул [35]. Эксперименты по определению внутриклеточной локализации селлюбревина показали, что белок находится преимущественно в структурах эндосомного происхождения.
Результаты трех независимых экспериментальных подходов указывают на участие белков семейства VAMP/ синаптобревинов в секреции. Во-первых, эти белки взаимодействуют с цитозольными белками NSF, а также - и -SNAP, которые являются необходимыми факторами слияния мембран [47].
Во-вторых, VAMP/ синаптобревины являются мишенями для протеолитической деградации клостридиальными нейротоксинами - тетанусным токсином и ботулиническим токсином серотипов В, D, F, G [39], которые блокируют высвобождение нейротрансмиттера в синапсах.
В-третьих, важная роль VAMP/ синаптобревинов в процессах секреции подтверждается результатами генетических экспериментов на дрожжах Saccharomyces cerevisial. Так, мутации в дрожжах по генам, кодирующим гомологи VAMP, приводят к значительным нарушениям конститутивной секреции [24]. При этом мутации по разным изоформам блокируют различные этапы секреторного процесса: транспорт везикул и эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи, из аппарата Гольджи к плазматической мембране и из аппарата Гольджи к вакуолям [42]. Мутации в этих генах приводят к нарушению секреции, которое выражается в накоплении везикул, не способных сливаться с плазмолеммой.
2.2. Синтаксины

Синтаксины представляют мультигенное семейство интегральных мембранных белков с молекулярной массой 35 кДа. Первый представитель этого семейства, синтаксин 1А/1В, был идентифицирован в нейронах крысы в морфологически детерминированном участке плазматической мембраны, формирующем зону синаптического контакта [11]. Белок демонстрировал способность к взаимодействию с мембранным белком синаптической везикулы, синаптотагмином (р65), и кальциевым каналом N-типа, который, вовлечен в регуляцию высвобождения нейротрансмиттера. Базируясь на этих наблюдениях, авторы предложили участие синтаксина в слипании/ слиянии мембраны синаптического пузырька с пресинаптической мембраной.
Множественные ненейрональные гомологи синтаксина 1А/1В были найдены в самых разных организмах: от дрожжей до человека [12]. При этом наблюдается избирательный характер распространения отдельных представителей в специфических клеточных фетотипах. Так, синтаксин 1А/1В присутствует исключительно в нейрональных и нейроэндокринных клетках. Синтаксины 2, 4 и 5 довольно широко распространены в разных клетках и тканях млекопитающих. В нейтрофилах человека также был идентифицирован представитель семейства синтаксинов, синтаксин 4 [16].
Синтаксины являются достаточно консервативными белками. Сравнение аминокислотных последовательности шести различных изоформ, присутствующих в тканях крысы, показывает 30-90 %-ную степень гомологии между отдельными белками [12]. При этом степень гомологии между синтаксинами 1А и 1В составляет 90 %, между синтаксинами 2-4 и синтаксинами 1А/1В варьирует от 46 до 64 %, а между синтаксином 5 и остальными белками составляет лишь 23-26 %. Синтаксинам свойственны общие черты структурной организации белковых молекул. Молекулы этих белков протяженностью в 288-301 аминокислотных остатков содержат на карбоксильном конце транс-мембранный домен. Этот домен играет важную роль в «заякоривании» белка в мембране, а также, и в детерминировании внутриклеточной локализации белка [34]. Каждый член семейства синтаксинов содержат несколько доменов, способных к образованию различных спиральных -спиралей, структур, которые участвуют в межмолекулярных белок-белковых взаимодействиях. Следует отметить, что синтаксинам присуще огромное разнообразие белок-белковых взаимодействий. Установлено, что синтаксин взаимодействует с синколлином, белком зимогеновых гранул поджелудочной железы [22], томосином, тубулином, киназой 5 и некоторыми другими белками. Функциональное значение этих взаимодействий в настоящее время выясняется.
Для синтаксинов характерна ассоциация с акцепторной мембраной, являющейся мишенью для транспортной везикулы. Поэтому синтаксины относят к t-SNARE (от английского слова target - мишень).
В клетках, способных к регулируемому экзоцитозу, синтаксины, главным образом, ассоциированы с плазматической мембраной. Однако недавно в литературе появились сообщения о существовании пула синтаксинов в мембранах секреторных везикул. Так, иммуно-электронной микроскопией установлено присутствие синтаксина 1А в мембранах синаптических пузырьков [33], а в зимогеновых гранулах поджелудочной железы обнаружен синтаксин 3. Эти данные противоречат традиционной точке зрения о синтаксинах, как и белках, функционирующих по типу t-SNARE. При этом не ясно, является ли везикулярный пул синтаксинов функционально значимым.
Как и в случае VAMP/ синаптобревинов, роль белков семейства синтаксинов в процессах секреции подверждается тремя линиями доказательств. 1) Гомологи синтаксина в дрожжах (белки Sso1, Sso2, Pep12, Sed5, T1g1p, T1g2p) необходимы для транспорта внутриклеточных везикул [24]. Белки Sso1 и Sso2 наиболее родственны нейрональным синтаксинам. 2) Ботулинический токсин серотипа С1, разщепляющий молекулы синтаксина, ингибирует высвобождение нейротрансмиттера. 3) Синтаксин взаимодействует с NSF и SNAP, белками, необходимыми для транспорта везикул через мембраны аппарата Гольджи [12].
2.3. SNAP-25

SNAP-25 принадлежит к семейству эволюционно консервативных белков, члены которого абсолютно необходимы для экзоцитоза. SNAP-25 был исходно обнаружен в синаптосомах. Белок локализуется в пресинаптической мембране, в связи с чем его, как и синтаксин, относят к t-SNARE.
В отличие от синаптобревина и синтаксина SNAP-25 не является интегральным мембранным белком. Молекулы SNAP-25 ассоциированы с мембраной, за счет жирнокислотных групп, модифицирующих остатки цистеина в центральной части молекулы [27]. В ходе альтернативного сплайсинга РИК образуются две нейронспецифичные изоформы SNAP-25, А и В, которые содержат аминокислотные замены в участке молекулы, вовлеченном в ассоциацию с плазматической мембраной. Эти изоформы имеют различные количественные и анатомические образцы экспрессии в нейронах при развитии мора, что указывает на возможность их участия в разных секреторных процессах.
Как и для описанных выше SNARE, на роль SNAP-25 в секреции указывают данные по осаждению этого белка на NSF/ SNAP аффинных сорбентах и деградации нейротоксинами [39].
До недавнего времени считалось, что SNAP-25 экспрессируется исключительно в нервной системе и нейроэндокринных клетках, таких как островки Лангерганса поджелудочной железы, хромаффинные клетки надпочечников, энтерхромаффинные клетки желудка. Однако экспрессия белка обнаружена также, хотя и в крайне малых количествах, в ограниченном наборе ненейрональных клеток, в частности скелетных мышцах и клетках жировой ткани [31]. Интересно, что оба указанных объекта содержат инсулин-зависимый транспортер глюкозы, GLUT 4. Транспортер находится во внутриклеточных везикулах, а при стимуляции клеток инсулином претерпевает транслокацию к плазматической мембране. SNAP-25 участвует в транслокации GLUT 4 по типу регулируемого экзоцитоза. Совсем недавно SNAP-25 обнаружен в ряде ненейрональных объектах, сперматозоидах морского ежа, где он принимает участие в акросомной реакции, и яйцеклетках мыши [28].
Если SNAP-25 действительно играет ключевую роль в процессах секреции, этот белок или его гомологи должны присутствовать во всех клетках, способных как к конститутивной секреции, так и к регулируемому экзоцитозу. Равичандран с сотрудниками клонировании новую изоформу SNAP-25, названную SNAP-23, которая демонстрирует 72 %-ную гомологию по аминокислотной последовательности со SNAP-25В. Изоформа была найдена во всех исследованных тканях крысы, в том числе мозге. В нейтрофилах человека также недавно было обнаружена экспрессия SNAP-23; причем белок, по-видимому, присутствует в этих клетках в двух изоформах, обозначенных SNAP-23А и SNAP-23В [37].
Распространение SNAP-23 в клетках и тканях указывает на возможность участия этого белка в конститутивной секреции, в то время как SNAP-25, по-видимому, требуется для регулируемой секреции.
2.4. NSF

NSF представляет цитозольный белок с молекулярной массой 76 кДа, обладающий АТФазной активностью. Молекула белка содержит в своем составе два АТФ-связывающих домена, которые необходимы для обеспечения процесса слияния мембран. Мутантные формы белка содержащие отдельные аминокислотные замены в АТФ-связывающих доменах, не способны катализировать гидролиз АТФ, что приводит к нарушениям в секреции [48]. АТФазная активность NSF индуцируется комплексом SNAP-синтаксин [9]. NSF выполняет универсальную функцию во всех клетках и требуется для слияния транспортной везикулы с самыми разными акцепторными мембранами как в ходе конститутивной, так и регулируемой секреции.
2.5. SNAP

Белки семейства SNAP являются цитозольными белками с молекулярной массой порядка 35-40 кДа, которые обеспечивают связывание NSF с мембранами, претерпевающими слипание/ слияние [48]. SNAP существует в тех изоформах, названных -, - и -SNAP. Два из этих белков, и найдены в самых разных клетках и тканях, в то время как -SNAP обнаруживается исключительно в мозге. и изоформы действуют совместно в процессах транспорта везикул между мембранами аппарата Гольджи, и оба эти белка требуются для оптимального связывания NSF с мембранами [45]. Однако следует отметить, что хотя оба белка прямо взаимодействуют с NSF, только -SNAP, контактирует с мембранным рецептором (SNARE) [44].
Роль и изоформ универсальна, в то время как -SNAP, выполняет какую-то специализированную функцию. Интересно при этом отметить, что синаптотагмин I, нейрон-специфичный белок, взаимодействует с -SNAP, но не способен связываться с двумя другими изофорамами SNAP [45]. Вполне возможно, что это белок - белковое взаимодействие необходимо для осуществления нейросекреции.
2.6. Механизм слипания/ слияния мембран

Молекулярный механизм слипания/слияния мембран, SNARE гипотеза, предложенный исходно для слияния мембраны синаптической везикулы с пресинаптической мембраной [47], представлен на рис.2.1. Гипотеза носит универсальный характер.
Исходно, перед сборкой функционального белкового комплекса синтаксин связан с белком цитозоля n-sec1, а VAMP с мембранным белком везикулы, син и т.д.................


Перейти к полному тексту работы



Смотреть похожие работы


* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.