На бирже курсовых и дипломных проектов можно найти образцы готовых работ или получить помощь в написании уникальных курсовых работ, дипломов, лабораторных работ, контрольных работ, диссертаций, рефератов. Так же вы мажете самостоятельно повысить уникальность своей работы для прохождения проверки на плагиат всего за несколько минут.

ЛИЧНЫЙ КАБИНЕТ 

 

Здравствуйте гость!

 

Логин:

Пароль:

 

Запомнить

 

 

Забыли пароль? Регистрация

Повышение уникальности

Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp», которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение уникальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения уникальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии и при повышении уникальности не вставляет в текст скрытых символов, и даже если препод скопирует текст в блокнот – не увидит ни каких отличий от текста в Word файле.

Результат поиска


Наименование:


научная работа Бактероцини

Информация:

Тип работы: научная работа. Добавлен: 26.04.2012. Сдан: 2011. Страниц: 9. Уникальность по antiplagiat.ru: < 30%

Описание (план):


Зміст
    стор
Перелік умовних позначень 2
Вступ   3
  ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ  
РОЗДІЛ 1 Бактеріоцини  
1.1. Класифікація  бактеріоцинів……………………………………….. 5
1.2. Бактеріоциногенність  та лізогенія………………………………… 6
1.3. Механізми кілерної дії бактеріоцинів на чутливі  клітини………. 8
1.4. Генетичні особливості бактеріоцинів родини Pseudomonas…….. 10
1.5. Піоцини…………………………………………………………… 12
  ЕКСПЕРЕМЕНТАЛЬНА  ЧАСТИНА  
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ  
2.1. Використані поживні  середовища і культури мікроорганізмів…. 14
2.2. Оцінка особливостей росту P. aeruginosa РАЕ - 22 при різних температурах…………………………………………………..……  
14
2.3. Оптимізація індукції з метою отримання бактеріоцинів  Pseudomonas aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом використання індуктора різної концентрації.………………………………………………………………...  
 
 
14
2.4. . Оптимізація  індукції з метою отримання  бактеріоцинів Pseudomonas aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом інкубування бактеріальної суспензії при різних температурах.…………………………………………………………………  
 
 
15
2.5. Оптимізація індукції з метою отримання бактеріоцинів  Pseudomonas aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом використання культури продуцента на різних фазах росту.………………………………………………………………  
 
 
15
2.6. Визначення  кілерної активності отриманих лізатів……………... 16
  РЕЗУЛЬТАТИ  
3.1. Визначення  особливостей росту P. aeruginosa РАЕ – 22 при різних температурах………………………………………………...  
18
3.2. Оптимізація індукції з метою отримання бактеріоцинів  P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом використання індуктора різної концентрації.……………..……..  
 
20
3.3. Оптимізація індукції з метою отримання бактеріоцинів  P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом інкубування бактеріальної суспензії при різних температурах……  
 
22
3.4. Оптимізація індукції з метою отримання бактеріоцинів  P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом використання культури продуцента на різних фазах росту……….  
 
23
ВИСНОВКИ………………………………………………………………………… 26
СПИСОК  ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ……………………………………… 27
 
Перелік умовних позначень
Rec A – рекомбінантний  білок
Lex A – репресорний  білок
ДНК – дезоксирибонуклеїнова  кислота
ColDF13 – плазміда
 

Вступ
     Вивчення  взаємовідносин між мікроорганізмами дозволило виділити явище антагоністичної  активності пов’язаної з синтезом бактеріоцинів.
     Бактеріоциногенність  є однією з найбільш поширених  систем захисту бактерій. Згідно з Klaenhammer, 99% усіх відомих мікрорганізмів здатні синтезувати, принаймні, хоча б один вид бактеріоцинів. Для деяких видів  бактерій можна спостерігати утворення  від 10 до 100 різних антибактеріальних  пептидів. Сучасний рівень знань про  бактеріоцини характеризується значною  неоднорідністю – одні кілерні фактори  вивчені досконало (коліцини, лактоцини), тоді як про інші відомо лише частково.
     Лізогенні системи в яких спостерігається  одночасне виділення бактеріоцинів  декількох типів є унікальними  системами для дослідження бактеріоциногенності [5].
     Бактеріоцини  – речовини бактеріального походження, білкової природи, виділяються більшістю  бактерій і характеризуються кілерною активністю відносно філогенетично  споріднених мікроорганізмів[1].
     В даний час основна увага приділяється дослідженню особливостей молекулярно-генетичної організації бактеріоцинів. Натомість, механізм індукції та виділення бактеріоцинів, основні способи їх впливу на чутливі  клітини мікроорганізмів, а також  значення даних кілерних факторів в  екології бактерій залишаються малодослідженими. Тому зважаючи на значну перспективу  застосування бактеріоцинів вивчення цих процесів є актуальним і потребує більш детального дослідження.
     Значне  розповсюдження мульти- та  панрезистентних  штамів мікроорганізмів значно обмежує  застосування антибіотиків в медицині. Для подолання цього явища  проводиться модифікація уже  відомих антибіотиків і пошук  принципово нових напрямків впливу на антибіотикорезистентні мікроорганізми. Одним із нових напрямків можна  розглядати фармакоензимологію.
     За  допомогою даного напрямку досліджень було розроблено попередники лікарських препаратів («prodrugs») - кон’югати різних антибіотичних структур, з’єднаних між собою ковалентним зв’язком. При потраплянні в організм людини цей зв'язок розщеплюється і кожний компонент взаємодіє з своєю мішенню. Проте вказані попередники не знайшли широкого використання в медичній практиці [2].
     Незважаючи  на певні досягнуті успіхи, необхідно  врахувати той факт, що лікувальний  потенціал антибіотиків знижується і резистентність мікроорганізмів  може зростати і далі. Це потребує пошуку нових, альтернативних антибактеріальних  препаратів. Одними із таких альтернативних речовин можна розглядати бактеріоцини. В даній роботі розглядаються  властивості бактеріоцинів та здатність  до бактеріоциногенності представників  родини Pseudomonas. Препарати на основі бактеріоцинів є перспективним напрямком дослідження оскільки ці речовини радикально відрізняються за властивостями та механізмами дії від антибіотиків. Відомо, що антибіотики не застосовуються в народному господарстві боротьби з збудниками різноманітних захворювань. На відміну від останніх, препарати на основі бактеріоцинів можуть знайти застосування, як в медицині, так і в різних сферах народного господарства.
     Відомо  також застосування бактеріоцинів  в якості консервантів харчових продуктів, оскільки дані речовини не впливають  на клітини еукаріотичних організмів. Яскравим представником бактеріоциноподібних речовин що активно застосовується в промисловості є «Нізин» [17].
     Таким чином бактеріоцини можна вважати  перспективними сполуками, що можуть знайти широке застосування в багатьох сферах людського існування.
 

     
     БАКТЕРІОЦИНИ
     1.1. Класифікація бактеріоцинів.
     Класифікація  бактеріоцинів на початковому етапі  досліджень була тісно пов’язана  із коліцинами. Дані речовини класифікували  за схемою, запропонованою Fredericq у 1957 році. Основним критерієм поділу в даному випадку, була специфічність їх адсорбції  та імунності, внаслідок чого коліцини поділені на декілька груп. Наприклад, коліцини Е1, Е2, Е3, які відрізняються  між собою імунністю, класифікували  в групу Е через їх здатність  адсорбуватись на спільному рецепторі.
     В подальших дослідженнях Reeves, проведених в 1965 році, було виділено 16 класів бактеріоцинів, які отримали назву відповідно до видів продуцентів. Наприклад, коліцини – бактеріоцини, які виділяються  E. coli, піоцини синтезуються Pseudomonas aeruginosa, тощо. Дані тривіальні назви які позначають мікроорганізми продуценти бактеріоцинів використовуються в практиці і досі.
     На  наступному етапі Bradely в 1967 запропонував поділити бактеріоцини за їх молекулярною масою на дві великі групи: низько- та високомолекулярні. Низькомолекулярні  бактеріоцини характеризуються високою  термостабільністю, чутливі до трипсину, не осаджуються при ультрацентрифугуванні  та не виявлялися при електронній  мікроскопії. На відміну від низькомолекулярних, високомолекулярні осаджуються  при ультрацентрифугуванні, характеризуються термолабільністю, не руйнувалися під  дією трипсину[1].
     Дослідження будови бактеріоцинів грам позитивних та грам негативних бактерій показало, що бактеріоцини грам позитивних бактерій потрібно виділити в окрему групу.
     Tagg запропонував змінити традиційне  значення терміну бактеріоцини, оскільки велика кількість описаних  часток володіє відмінними від  коліцинів властивостями. Дані  структури, на його думку, необхідно  виділити в окрему групу як  бактеріоцини подібні інгібуючі  субстанції (BLIS).
 

     1.2. Бактеріоциногенність  та лізогенія.
     В ряді досліджень робилися спроби порівняти  бактеріоцини та бактеріофаги. Вивчення ультраструктури показало наявність  певної схожості між цими двома бактерицидними агентами. В зв’язку з цим бактеріоцини певний час розглядали як дефектні фаги. Фаги складаються з головки  та хвоста і вкриті оболонкою. Бактеріоцини за своєю структурою нагадують фагові хвости. Проте дослідити структуру  бактеріоцинів та фагів одного штаму  досить складно, оскільки обидва агенти можуть адсорбуватися на однакових  рецепторах клітин-мішеней та спричиняти їх загибель.
     Виділення бактеріоцинів та бактеріофагів  пов’язане з пошкоджуючим впливом  на нуклеїнові кислоти клітини фізичних та хімічних факторів. До таких факторів можна віднести УФ-випромінювання, дію мітоміцину С, тощо.
     Реакція клітин на дію індукторів пов'язана  з активацією системи захисту  клітин – SOS-система. В результаті пошкоджую  чого впливу виникає SOS-відповідь. Індукція фагів або бактеріоцинів є лише одинією з багатьох відповідей бактерії на дію індуктора. Показано, що в даному випадку включається синтез близько 10-20 бактеріальних генів, які допомагають бактерії у репарації. Ці гени в сукупності називають SOS-системою, а їх активація - SOS-відповіддю клітини.
     Механізм індукції генів бактеріоцинів під дією УФ-світла такий же, як при індукції фагів в лізогенних клітинах. УФ-опромінення викликає пошкодження ДНК. У результаті білок Reс А, який зазвичай сприяє рекомбінації між молекулами ДНК, перетворюється в особливу протеазу. Вона розщеплює ?-репресор, запускаючи тим самим індукцію. Reс А розщеплює також ще принаймні один репресор клітини господаря Lex А [4].
     Lex А за структуроюі функцією подібний до репресора ?. Мономер Lex А складається з двох доменів: аміно-кислотного, котрий розпізнає ДНК, і карбоксильного, який утримує субодиниці у складі димеру. Білок Lex А пригнічує активність деяких генів, продукти викорстовуються бактерією при репарації. При УФ-опроміненні Reс А інактивує Lex А і запускається синтез.
     Репрессор ?, подібно репресорам інших фагів Е. coli, розщеплюється при SOS-відповіді клітини. Після чого відбувається синтез фагових генів, розпочинається літичний цикл розвитку.
     SOS-система запускається не тільки під дією УФ-опромінення. Як правило, її може активувати будь-яка речовина із нуклеарною активністю наприклад канцероген. Бензпірен - одне із з'єднань, що викликає утворення пухлин у тварин. Сам по собі бензпірен інертний, але після модифікації під дією ферменту, який знаходиться в печінці тварин, він реагує з ДНК і спричиняє її пошкодження. Якщо бензпірен ввести безпосередньо в середовище, він не буде впливати на бактерії, але модифікації за допомогою ферментів печінки спричинить індукцію SOS-відповіді [4].
     Здатність того чи іншого з'єднання індукувати SOS-відповідь корелює з його здатністю викликати утворення пухлин у тварин, і хоча суперечки з приводу правомірності такої кореляції тривають, бактерії використовують в якості чутливих детекторів при перевірці речовин на канцерогенність. Застосовують два основних тести: індукцію зростання фага в лізогенних бактеріях і поява мутантів в нелізогенних культурах. Останній підхід лежить в основі відомого тесту Еймса на канцерогенність. В обох випадках перше, що відбувається відразу після попошкодження ДНК - індукція експресії генів. Для індукції фага необхідно, щоб Reс А розщепив репресор активував фагові гени, а для мутагенезу необхідно, розщеплення білком Reс А репресора Lex A і активація бактеріальних генів. [4].
 

      1.3. Механізми кілерної дії бактеріоцинів на чутливі клітини.
     Бактеріоцини  впливають на клітини шляхом адсорбції  до специфічних рецепторів, на поверхні клітин-мішеней, після чого здійснюється їх транспорт до специфічних мішеней. Одні бактеріоцини інгібують процеси  синтезу білка (коліцин Е3), інші – специфічно пригнічують синтез ДНК та сприяють її деградації (коліцин Е2). Одним із механізмів впливу бактеріоцинів є порушення активного транспорту, що призводить до виходу іонів із бактеріальної клітини і руйнування енергетичного потенціалу біологічних мембран (коліцини А, Е1, К, Іа). Це призводить до інгібування синтезу білку та нуклеїнових кислот, унеможливлення транспорту електронів та активного транспорту калію. При цьому формуються специфічні іоно-пропускні канали і клітини додатково втрачають іони калію та магнію. Такі зміни приводять до загибелі клітині-мішені.
     При синтезі бактеріоцинів також  синтезується білок імунності, який здатний взаємодіяти з бактеріоцином  і інактивувати його. Використовуючи методи конструювання гібридних  білків було доведено, що С-термінальний поро-утворюючий домен бактеріоцинів  проявляв чутливість до імунного білку  даних речовин. Виходячи з цього  було зроблено висновок, що імунні білки  поро-утворюючих бактеріоцинів взаємодіють  з поро-утворюючим доменом відповідного бактеріоцину та інактивують його, що запобігає процесу ліричного  впливу на клітину.
     Секретовані бактеріоцини звільняються після експресії  генів, що кодують бактеріоцин-звільнюючий  білок, який викликає лізис клітин. Дана речовина носить назву лізуючий або кілерний білок. Ці білки виділяються  у цитоплазмі в розчиненому стані  до вивільнення бактеріоцинів. Найбільш вивченими з кілерних білків є  коліцини, які разом з бактеріоцинзвільнюючим білком кодуються в генах плазміди ColDF13. Дані речовини схожі за багатьма властивостями до білків інших бактеріоцинів  включаючи їх генетичну організацію, особливості транскрипції, синтезу, та виділення.
     Характерний для бактеріоцинів кілерний процес є кінетичним явищем. Дослідження  кілерного впливу на чутливі клітини  бактеріоцинів проводили також  за допомогою електронної мікроскопії. Показано, що механізм їх впливу пов'язаний як з морфологічними змінами в  самих бактеріоцинах так і  в  чутливих клітинах.
       В дослідженнях було показано, що бактеріоцини грам-позитивних  бактерій відносяться до низькомолекулярних  сполук. Морфологічні зміни, які  спричинюють дані були пов’язані  з втратою рибосом, концентрування  нуклеїнових матеріалів, модифікацією  мезосом. Високомолекулярні бактеріоцини  грам-негативних бактерій це високомолекулярні  структури, що візуалізуються  електронній мікроскопії. Дослідження  показали, що ці частинки зв’язувалися  із чутливими клітинами за  допомогою  базальних пластинок.  При цьому спостерігається загальне  руйнування клітини мішені. Встановлено,  що внаслідок дії цих частинок  бактеріальні клітини гинули  на 90% від загальної кількості  проаналізованих [1].
 

      1.4. Генетичні особливості бактеріоцинів родини Pseudomonas.
     Дослідження піоцинів показало наявність структур, схожих на фагових хвостових відростків, які були класифіковані як піоцини R та F типу. Були спроби знайти фаги, які  могли бути попередниками даних  піоцинів. В результаті ряду досліджень ізольовано певні фаги, які позначили  як R та F споріднені. Ця спорідненість  виявлялася у здатності антисироватки, проти піоцинів, нейтралізувати також  і ізольовані фаги. Так, наприклад, фаги PS3 і PS17 нейтралізувалися анти-R-сироваткою, а фаг KF1-нейтралізувався анти-F-сироваткою. Було доведено, що можливий обмін компонентами R піоцином та фагом PS17, відомий як фенотиповий  міксинг. Безголові мутанти фагу PS17 із відсутньою голівкою проявляли  вплив на чутливі клітини, схожий з впливом R піоцинів. Окрім даних  фагів також було ізольовано цитотоксин-конвертуючий фаг, який також виявляв спорідненість  до R піоцинів [3].
     В ході ряду генетичних досліджень та сиквенування геному Pseudomonas aeruginosa на бактеріальній хромосомі було виявлено кластер генів в якому було закодовано структурні гени та гени активації бактеріоцинів. Дані гени розташовуються на відрізку між генами trpE та trpGCD, і поділені на п’ять кластерів: I – гени регулятори експресії, II – гени невідомої функції, III – гени, що відповідають за функцію лізису, IV - структурні гени R піоцинів, V – структурні гени F піоцинів [3].
     Структурні  гени піоцинів F типу локалізовані між  кластером генів R піоцинів та trpGCD. Для піоцинів R типу в свою чергу було ідентифіковано 14 генів – trpA-N та trpR, які розміщені на фрагменті розміром 13kb між генами trpE та trpGCD. Гени prtR та prtN виступали регуляторами експресії генів піоцинів. Білок гена prtN розглядається як транскрипційний активатор для всіх типів піоцинів. Сайтом зв’язування для цього є структура, названа P-box. Білок РrtR репресує ген prtN, та інактивується за наявності активованого RecA. УФ-випромінювання або дія мітоміцину С, які розглядаються як класичні індуктори бактеріоцинів, запускає експресію генів піоцинів. Гени, що кодують функціональні білки є еволюційно консервативними.
     При дослідженнях із використанням мутантних  штамів P. aeruginosa, які втратили здатність до утворення піоцинів R типу. Було виявлено відрізки генів, які відповідали приблизно двом рамкам зчитування, і могли бути регуляторними відрізки експресії генів піоцинів. Механізм, за яким функціонують дані послідовності схожих за функцією P-box. Можливо дані структури є сайтами зв’язування для транскрипційного активатора prtN.
     Гени, які містять R-піоцин специфічну ділянку  характеризуються високою гомологією з генами, хвостів фагів родини Р2, як Р2, 186 та ?СТХ. З 16 рамок зчитування 12 виявилися високогомологічними  до генів Р2 та ?СТХ. В багатьох подвійно-закручених спіралей ДНК фагів родини Р2 N-термінальний кінець білку хвоста відповідає за зв’язування із базальними пластинками, а С-кінець за з’єднання з рецепторами  клітини мішені. Відповідно, до описаного  гену, в яких закодовані інші піоцини F-типу, виявилися високогомологічними  до генів, кодуючих хвости фагів родини ?.
     В результаті даних досліджень було зроблено висновки, що базальні пластинки фагів  Р2, ?СТХ та піоцинів R типу є близькоспорідненими,  рецептори для піоцинів R типу та фагів містять оліго- та ліпополісахариди, а сайти зв’язування в ліпополісахаридному  шарі P. aeruginosa для ?СТХ та R піоцинів відрізняються [3].
 

      Розділ 1.5. Піоцини
     Бактеріоцини  – білкові молекули, які містять  у своєму складі також вуглеводи (1%) та фосфор (0,1%) [1].
     В давніших роботах по дослідженню  коліцинів було виявлено структури  різного складу. Одні з них були ліпополісахаридними білковими  комплексами асоційованими з  О-соматичним антигеном, такий як К-К 235, і враховуючи його структуру активність була пов`язана з карбоксильною  частиною. В той час як інший  містив мало, або зовсім не містив, вуглеводів – Е2-Е9, з молекулярною масою близько 60 кДа. Інші, схожі на коліцин Е2, були також досліджені і містили низький  рівень вуглеводів(>10%).
     Одним із досліджених бактеріоцинів є  бактеріоцини родини Pseudomonas – піоцини, які поділяються на три типи: R, F та S-тип.
     Піоцини R-типу є білковими частками вільними від вуглеводних залишків і нуклеїнових  кислот. Далі піоцини нагадують негнучкі та скорочувальні схожі з хвостами бактеріофагів. Дані піоцини були розділені  на п`ять груп: R1, R2, R3, R4 та R5, які схожі  за своєю будовою та серологічними  властивостями, але відрізняються  за специфічністю рецептора до якого  відбувається приєднання. Механізм їх дії пов'язаний з деполяризацією цитоплазматичної мембрани та інгібуванням активного транспорту в клітині  мішені.
     Піоцини F типу також мають будову схожу  з хвостами бактеріофагів, але на відміну від R, гнучку та не скорочувальну. На сьогоднішній день піоцини F типу поділяються  на три групи: F1,F2 та F3. Дані піоцини  мають схожу структуру та серологічні  властивості, але відрізняються  за специфічністю рецептора.
     Піоцини S типу, отримані при індукції мітоміцином  С, відрізняються від попередніх швидкістю дифузії через агар, чутливістю до протеаз. Поділяються  на: S1, S2, S3  та AP41. Між собою відрізняються  різним кілерним спектром, в усіх випадках проявляється ДНКазна активність.
     Всі бактеріоцини є гетерогенними структурами  від низькомолекулярних до високомолекулярних часток з комплексною структурою, але кілерна активність повязана виключно білковою в частиною[1].
 


ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
     РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
     2.1. Використані поживні середовища  і культури мікроорганізмів
     Для культивування мікроорганізмів  в рідкому середовищі використовували  МПБ, перевірку кілерної активності проводили на чашках із щільним середовищем  МПА, поверх якого наносили індикаторні культури у складі напіврідкого 0,7% - ного агару.
     Одержання бактеріоцинів здійснювали із Pseudomonas aeruginosa РАЕ - 22 отриманого із УКМ (Української колекції мікроорганізмів, Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України).
     Як  індикаторні культури застосовували  штами P. aeruginosa УКМ В-3 і УКМ В-10. 

     2.2. Оцінка особливостей росту P. aeruginosa РАЕ - 22 при різних температурах.
     Суспензію штама – продуцента із добової  культури відбирали на 16,18, 20 та 22 годину росту. В подальшому проводили розведення бактеріальної суспензії в МПБ у співвідношенні 1:20 (по об’єму). Інкубування проводили при 20, 28, 37°С на качалці (240 об/хв.) протягом 6-8 годин. Кожну годину із суспензії відбирали матеріал і визначали титр мікроорганізмів. За отриманими результатами будували криві росту мікроорганізмів і визначали час подвоєння. 

     2.3. Оптимізація індукції з метою  отримання бактеріоцинів P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом використання індуктора різної концентрації.
     Для отримання бактеріоцинів добову культуру штама-продуцента розводили  з МПБ у співвідношенні 1:20 (по об’єму) і підрощували на качалці (240 об/хв.) при 37°С протягом 3-х годин. У якості індуктора було використано  налідиксову кислоту, яку вносили до кінцевих концентрацій 10, 100 та 500 мкг/мл. В подальшому суспензія додатково інкубувалась 3 год., за вказаних вище умов. Наступним етапом було внесення в суспензію хлороформу у співвідношенні 1:50 (по об’єму) та повторне інкубування на протязі 3-х год. за описаних вище умов. Очистку отриманих лізатів проводили шляхом низько швидкісного центрифугування при 6000 тис. об/хв., протягом 30 хв. Отримані супернатанти асептично відбирали і зберігали в закритих ємкостях при 4-6°С. У якості консерванту використовували хлороформ. 

     2.4. Оптимізація індукції з метою  отримання бактеріоцинів P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом інкубування бактеріальної суспензії при різних температурах.
     Для отримання бактеріоцинів добову культуру штама-продуцента розводили  з МПБ у співвідношенні 1:20 (по об’єму) і підрощували на качалці (240 об/хв) при 20, 28 та 37°С протягом 3-х  годин. У якості індуктора було використано  налідиксову кислоту, яку вносили до кінцевої концентрації 100 мкг/мл. В подальшому суспензія додатково інкубувалась 3 год., за вказаних вище умов. Наступним етапом було внесення в суспензію хлороформу у співвідношенні 1:20 (по об’єму) та повторне інкубування на протязі 3-х год. за описаних вище умов. Очистку отриманих лізатів проводили шляхом низько швидкісного центрифугування при 6000 тис.об/хв., протягом 30 хв. Отримані супернатанти асептично відбирали і зберігали в закритих ємкостях при 4-6°С. У якості консерванту використовували хлороформ. 

     2.5 Оптимізація індукції з метою отримання бактеріоцинів P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом використання культури продуцента на різних фазах росту.
     Для отримання бактеріоцинів добову культуру штама-продуцента розводили  з МПБ у співвідношенні 1:20 (по об’єму) і підрощували на качалці (240 об/хв) при 37°С протягом 2, 3, 4, та 5-ти годин. У якості індуктора було використано  налідиксову кислоту, яку вносили до кінцевої концентрації 100 мкг/мл. В подальшому суспензія додатково інкубувалась 3 години, за вказаних вище умов. Наступним етапом було внесення в суспензію хлороформу у співвідношенні 1:20 (по об’єму) та повторне інкубування протяом 3-х год. за описаних вище умов. Очистку отриманих лізатів проводили шляхом низько швидкісного центрифугування при 6000 тис.об/хв., протягом 30 хв. Отримані супернатанти зберігали в закритих ємкостях при 4-6°С. У якості консерванту використовували хлороформ. 

     2.6. Визначення кілерної активності отриманих лізатів
     Кілерну активність перевіряли методом «двошарового агару». З цією метою розплавлений і охолоджений до 50-55° С напіврідкий (0,7% - ний) агар вносили підрощену добову культуру індикаторного штаму і нашаровували на МПА в чашці Петрі. Після застигання верхнього агару на газон індикаторної культури наносили отримані лізати об’ємом 5 мкл. Чашки інкубували протягом 18-24 год. при 28° С. Утворення на газоні з індикаторною культурою негативних зон затримки росту вказувало на наявність в досліджуваних лізатах речовин із кілерними властивостями стосовно використаного індикаторного штаму.
     Кількісні параметри активності відповідних  лізатів визначали шляхом подвійних серійних розведень до 1:4096. Аліквоти кожного із розведень наносили на газон і визначали найбільше розведення, при якому спостерігалась поява негативних зон лізису. Дане розведення приймали за активність досліджуваної речовини. 

 


     РЕЗУЛЬТАТИ
     Відомо, що мікроорганізми здатні виділяти бактеріоцини, які впливають на філогенетично  споріднені штами. Раніше нами було показано, що P. аeruginosa РАЕ – 22 є продуцентом високоактивних бактеріоциноподібних речовин. Тому, метою нашої роботи було оптимізація індукції з метою отримання зазначених речовин у максимальних концентраціях. Перевірку активності проводили на індикаторних культурах P. aeruginosa В-3 та В-10. 

     3.1. Визначення особливостей росту P. aeruginosa РАЕ – 22 при різних температурах.
     Визначення  особливостей росту штама-продуцента проводили з метою оцінки оптимальних  умов його інкубування. Було показано, що титр мікроорганізмів в 16, 18, 20, та 22-х годинних культурах був приблизно однаковий, в межах статистичної похибки (табл.. 3.1.).
     Таблиця 3.1.
     Титр штама-продуцента в добовій культурі.

и т.д.................


Тривалість  інкубування год. 16 18 20 22
Титр мікроорганізмів КУО/мл 3,6 х 109 2,1 х109

Перейти к полному тексту работы


Скачать работу с онлайн повышением уникальности до 90% по antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru


Смотреть полный текст работы бесплатно


Смотреть похожие работы


* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.