На бирже курсовых и дипломных проектов можно найти образцы готовых работ или получить помощь в написании уникальных курсовых работ, дипломов, лабораторных работ, контрольных работ, диссертаций, рефератов. Так же вы мажете самостоятельно повысить уникальность своей работы для прохождения проверки на плагиат всего за несколько минут.

ЛИЧНЫЙ КАБИНЕТ 

 

Здравствуйте гость!

 

Логин:

Пароль:

 

Запомнить

 

 

Забыли пароль? Регистрация

Повышение уникальности

Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp», которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение уникальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения уникальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии и при повышении уникальности не вставляет в текст скрытых символов, и даже если препод скопирует текст в блокнот – не увидит ни каких отличий от текста в Word файле.

Результат поиска


Наименование:


курсовая работа Биосинтез ксиланаз аборигенными штаммами Trichoderma

Информация:

Тип работы: курсовая работа. Добавлен: 11.08.2012. Сдан: 2011. Страниц: 7. Уникальность по antiplagiat.ru: < 30%

Описание (план):


     Министерство  образования и  науки РФ
     Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования
«Казанский (Приволжский) федеральный Университет»
     БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ  ФАКУЛЬТЕТ 

     КАФЕДРА БИОХИМИИ
     Специальность: 011600 (020208) - биохимия 
 

     КУРСОВАЯ  РАБОТА 

     Биосинтез ксиланаз аборигенными штаммами Trichoderma 

     Студент III курса
     Группа 180
     «__» ________ 2011 г.  ________________(Э.Л. Перес Хусаенова)
     Научные руководители 

     к.б.н.,с.н.с.
     «__» ________2011г.  ________________(Р.И. Тухбатова) 

     д.б.н., профессор
     «__» ________2011г.  ________________(Ф.К. Алимова) 
 

     Казань - 2011 

     СОДЕРЖАНИЕ

     ВВЕДЕНИЕ

 
     Ксилан  – второй по распространенности природный полимер после целлюлозы, он встречается практически во всех растительных тканях.
     Во  многих технологических процессах, прежде всего при производстве бумаги и целлюлозы, ксилан является нежелательной примесью, и встает проблема его деградации. Также необходимо гидролизовать ксилан в некоторых процессах пищевой и кормовой промышленности, и при комплексной переработке растительных отходов.
     Гидролиз  ксилана возможно осуществлять с  помощью химических реагентов или  ферментативным путем. Ферментативный гидролиз является предпочтительным, так как меньше влияет на структуру  других волокон, и при нем образуется меньше химических отходов. В пищевой или кормовой промышленности, химический гидролиз вообще неприемлем.
     В современной промышленности используются ксиланазы бактериального и грибного происхождения.
     Изучение  синтеза ксиланолитических ферментов  мицелиальными грибами объясняется не только растущей потребностью современной промышленности в этих ферментах, но и тем, что это удобная модель для изучения регуляции транскрипции эукариотических генов и секреции белков. Являясь одними из простейших эукариотических организмов, мицелиальные грибы представляют собой удобный объект для изучения.
     В настоящее время основными продуцентами ксиланаз грибного происхождения являются грибы родов Aspergillus и Trichoderma. В связи с этим целью данной работы явилось изучение биосинтеза ксиланаз грибами рода Trichoderma на послеспиртовой барде.
     Исходя  из цели работы, были поставлены следующие  задачи:
    Определить динамику ксиланазной активности при культивировании грибов рода Trichoderma на послеспиртовой барде.
    Определить влияние редуцирующих сахаров культуральной среды на динамику синтеза гидролитических экзоферментов Trichoderma.
    Определить влияние pH на активность ксиланаз.

     1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

     1.1 Общая характеристика  рода Trichoderma

     Грибы рода Trichoderma являются сапротрофами, способными усваивать большой спектр органических веществ и обладающими способностью активно подавлять конкурентов.
     Представителей  рода Trichoderma можно найти практически во всех почвах. Их считают, по крайней мере частично, ответственными за эффект биологического контроля фитопатогенов в супрессивных почвах, на которых зерновые и деревья не подвергаются действию патогенна [Кучмина с соавт., 2001]. Грибы рода Trichoderma обильнее размножаются в почвах, богатых органическими веществами, т.к. количество углерода и азота и соотношение этих элементов в значительной степени влияют на развитие Trichoderma. Наиболее заметны эти грибы на мёртвой древесине [Samuels, 1996]. Из выше указанного видно, что грибы рода Trichoderma встречаются повсеместно, и распространение отдельных видов зависит в основном от абиотических факторов окружающей среды (температура, влажность субстрата и содержание органических веществ).
     На  сегодняшний день этот род делят  на три секции по по морфологическим характеристикам:
     Trichoderma sect. Triсhoderma, Trichoderma sect. Pachybasium, Trichoderma sect. Longibraсhiatum. Бесспорно только выделение секции Longibrachiatum, так как доказано её монофилетическое происхождение [Samuels et al., 2001], а секции Trichoderma и Pachybasium имеют полифилетическое происхождение и деление на их чисто искусственное [Крапивина с соавт., 1975].
     На  данный момент описано около 200 видов  Hypocrea, и около половины из них имеет анаморфу, относящуюся к роду Trichoderma. Т.о. существует, по крайней мере, 100 естественных видов Trichoderma, но, возможно, их ещё больше, поскольку клоны, потерявшие способность к половому размножению, могут эволюционировать самостоятельно [Samuels et al., 2003].

     1.2 Ферменты, их свойства

     Будучи  белками, ферменты обладают всеми их свойствами. Сюда относятся термолабильность ферментов, зависимость их действия от значения рН среды, специфичность, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов [Campbell, Bedford, 1992]. Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с одной стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком высоком значении к денатурации белка и снижению каталитической функции, а с другой стороны, оказывает влияние на скорость реакции образования фермент субстратного комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрата. Кроме того, для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. Большинство ферментов имеет максимальную активность в зоне рН поблизости от нейтральной точки. Специфичность – одно из наиболее выдающихся свойств ферментов. Данное свойство ферментов объясняется в первую очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента.
     По  характеру катализируемых процессов  ферменты делят на шесть классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы, которые представлены в таблице 1.
     Таблица 1
     Классы  ферментов
№ класса Название  класса Типы  катализируемых реакций
1 Оксидоредуктазы Окислительно-восстановительные  реакции
2 Трансферазы Перенос групп
3 Гидролазы Гидролиз
4 Лиазы Расщепление негидролитическим  путем связей С-С, отщепление групп  с образованием двойной связи, присоединение  по двойной связи
5 Изомеразы Реакции изомеризации
6 Лигазы (синтетазы) Химические  взаимодействия молекул с использованием энергии АТФ (или других высокоэнергетических соединений)
 
     Гидролазы – ферменты, катализирующие разрыв внутримолекулярных связей, при участии  воды. В зависимости от химической природы гидролизуемого субстрата  этот большой класс ферментов подразделяется на тринадцать подклассов. Один из них гликозидазы – ферменты, ускоряющие гидролиз гликозидов, ди-, три- и полисахаридов. К ним относятся ксиланазы – ферменты, гидролизующие полимерные цепочки ксиланов, и целлюлазы – ферменты, гидролизующие ?-1,4- связи целлюлозы.

     1.3 Ферменты микромицета рода Trichoderma

     Ферменты, секретируемые Trichoderma, характеризуются сложностью состава. Есть данные о способности у диких штаммов к секреции эндохитиназ, хитобиозидаз, ?-N-ацетилгексозаминидаз, ?-1,6-глюканаз, протеаз, ДНКаз, целлюлаз, ксиланаз, уреаз, РНКаз, пектиназ, пектинлиаз, лактаз, пероксидаз [Маркович, Кононова, 2003].
     Большинство штаммов Trichoderma описано в научной литературе в качестве целлюлолитиков и гемицеллюлолитиков.
     В настоящее время, в связи с большой востребованностью в сельском хозяйстве, производстве чистящих средств и перерабатывающей промышленности [Сabrera et.al., 2010], производство гидролитических ферментов является крупнотоннажным процессом. Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз различные штаммы T. reesei и T. longibrachiatum играют ведущую роль [Шульга, 2008]. Грибы Trichoderma также являются эффективными продуцентами ксиланаз. Кроме того, известно, что грибы рода Trichoderma являются продуцентами метаболитов, обладающих высокой антибиотической активностью в отношении грибов и бактерий. Чрезвычайно перспективными представляются в этом отношении грибы T. citrinoviride, T. asperellum,T. hamatum, T. harzianum. Описано получение из культуральной жидкости этих грибов антибиотиков – пептабойлов. Показано, что эти антибиотики высокоактивны в отношении грибов, грамположительных бактерий и микобактерий [Шариков с соавт., 2011].

     1.4 Гидролазы грибов

     В настоящее время основными продуцентами ксиланаз грибного происхождения являются грибы родов Aspergillus и Trichoderma. В то же время, постоянно ведется поиск новых продуцентов, вызванный потребностью в ферментах с улучшенными свойствами, и желанием расширить спектр существующих продуцентов [Серебряный, 2009]. В качестве продуцентов ксиланаз, в настоящее время также используют грибы рода Humicola и Penicillium [Алимова с соавт., 2007].
     При культивировании Aspergillus sulphureus твердофазным способом было отмечено существенное влияние температуры и влажности на биосинтез гидролаз [Lu et al., 2003]. Подходящие условия для синтеза ксиланаз 30-35?С, влажность 40-50%. В ходе культивирования выделяется значительное количество теплоты. Эффективно поддерживать температуру ферментации позволяет вентилирование субстрата. Применение описанной технологии позволяет получить препарат ксиланаз активностью 1000 IU/г, в сравнении с 650 IU/г при культивировании на сухом субстрате [Saha, 2002]

     1.5 Характеристика ксиланазного комплекса Trichoderma

     Ксиланазы – ферменты, гидролизующие линейные полисахариды бета-1,4 – ксилана в ксилозу, таким образом, деградирует гемицеллюлозы, одни из основных составляющих растительной клеточной стенки. Их относят по международной классификации ферментов к гликозидазам. Большинство грибных ксиланаз принадлежат к 10-му и 11-му семействам гликозил-гидролаз, различающихся по своим физическим свойствам, по субстратной специфичности и оптимуму рН. Многие грибы имеют гены, кодирующие несколько различных ксиланаз, принадлежащих как к одному, так и к разным семействам, и синтезируют несколько ксиланаз одновременно [de Vries R.P., 2002]. У некоторых видов обнаружен синтез только одного фермента.
     Все ксиланазы являются двухкомпонентными ферментами, они содержат белковую и углеводную составляющие. Для полного гидролиза ксилана необходимо участие следующих ферментов: эндоксиланаза ЕС3.2.1.8, экзоксиланаза ЕС3.2.1.37, b-D-ксилозидаза ЕС3.2.1.37, a-L-арабинофуранизидаза ЕС 3.2.1.55 [Марков с соав., 2006].
     Основным  ферментом, деполимеризующим ксилан, является эндо-?-l,4-ксиланаза - ксиланаза II [Lopez et al., 2011]. Этот фермент расщепляет главным образом центральные части основной цепи ксилана. Остальные ферменты работают синергично с ней. Экзоксиланаза и b-D-ксилозидаза атакуют короткие полимерные цепочки ксилана – продукты гидролиза эндо-?-l,4-ксиланазы. a-L-арабинофуранизидаза гидролизует боковые цепочки, создавая новые сайты для эндо-ксиланазы.

     1.6 Строение ксилана

     Перспективное направление биотехнологии – биоконверсия растительной массы в целях получения биотоплива (этанола и бутанола) в качестве конечного продукта. Ключевой стадией этого процесса является ферментный гидролиз биомассы до сбраживаемых сахаров. Поскольку некоторые микроорганизмы способны превращать пентозы (ксилозу и арабинозу) в этанол и бутанол, дополнительным источником биотоплива могут быть растительные ксиланы. Ксилан является основным гемицеллюлозным компонентом клеточной стенки растений и вторым по распространенности природным полисахаридом после целлюлозы [Семёнова и др., 2009]. В зависимости от происхождения, структура и химический состав ксилана значительно меняются, но, в любом случае, главная цепь образована ?-1,4-связанными остатками D-ксилозы. В качестве ответвлений встречаются различные заместители, чаще всего арабиноза [Серебряный, 2009].
     Так как структура ксилана у разных видов растений разная, требуется большое разнообразие объединено действующих ферментов таких как – ксиланаза, ксилозидаза, арабинофуранозидаза, ацетилксилан эстераза. Эти ферменты действуют совместно, разлагая ксилан до сахаров [Tison et.al., 2009].
     Во  многих технологических процессах, прежде всего при производстве бумаги и целлюлозы, ксилан является нежелательной  примесью, и встает проблема его  деградации. Также необходимо гидролизовать  ксилан в некоторых процессах  пищевой и кормовой промышленности, и при комплексной переработке растительных отходов. Гидролиз ксилана возможно осуществлять с помощью химических реагентов или ферментативным путем. Ферментативный гидролиз является предпочтительным, так как меньше влияет на структуру других волокон, и при нем образуется меньше химических отходов. В пищевой или кормовой промышленности, химический гидролиз вообще неприемлем [Серебряный, 2009].
     Не  смотря на то, что для исчерпывающего ферментативного гидролиза ксилана, включающего расщепление боковых цепей, требуется достаточно широкий спектр ферментов, в большинстве технологических процессов достаточно действия фермента, расщепляющего главную цепь ксилана – эндо-?-1,4-ксиланазы.
     Ксилан  составляет до 30% от общего количества полисахаридов в клеточных стенках растений. В зависимости от источника и способов выделения природные ксиланы могут иметь как линейную, так и разветвлённую форму [Марков с соавт., 2006]. Наиболее распространённым типом природных ксиланов является глюкуроноксилан – основной ксилан твёрдых (лиственных) пород деревьев и арабиноксилан, входящий в состав древесины мягких (хвойных) пород деревьев, а также ксилан злаковых растений.

     1.7 Биосинтез ксиланаз

     Гриб  – продуцент ксиланаз значительно  увеличивает синтез ферментов при наличии в среде специфических веществ-индукторов, как правило, являющихся продуктами неполного гидролиза субстрата. Благодаря наличию такого специфического биохимического механизма регулирования, генетический аппарат клетки настраивается на синтез такого ферментного комплекса, который, поступая во внешнюю среду, способствует максимальному гидролизу субстрата. Так при использовании «химических» индукторов, таких как очищенные микроцеллюлоза и глюкан, было отмечено увеличение выхода фермента и снижение  его себестоимости [Околелова с соавт., 2001].
     B результате изучения процесса  культивирования Trichoderma reesei в диапазоне рН 4.8 – 7.0 и анализа активности экзогенных ксиланаз установлено, что оптимальное рН синтеза ксиланаз 6.4 – 6.7. Максимум активности ферментов достигается при рН 4.8, величина оптимума в данном случае практически совпадает с физиологическим оптимумом рН=5,0 в верхних отделах тонкого кишечника [Colina A et al, 2003].

     1.8 Послеспиртовая барда

     При производстве спирта из зерна (например, пшеницы, кукурузы или ржи) получается довольно большое количество отработанной массы прошедшего ферментацию сырья, из которого путем дистилляции извлекается алкоголь [Шишкин с соавт., 2007]. В настоящее время в пищевых перерабатывающих отраслях промышленности России, и в частности в спиртовой промышленности, продолжает остро стоять проблема переработки вторичных ресурсов, образующихся в процессе производства пищевой продукции [Ненайденко, 2008]. Ее необходимо решать на уровне каждого спиртового завода. Причин тому, по меньшей мере, две: барда имеет ограниченный сбыт в качестве корма, не покрывающий объемы ее производства, а во-вторых, барда содержит большое количество ценных веществ, таких как протеины, связанные сахара, минеральные и органические соли и т.д. и может с успехом использоваться для получения топлива, ферментных препаратов или органических удобрений. В мировой и отечественной практике используется несколько типовых технологических процессов, которые в той или иной степени способны решить проблему переработки барды. К основным типовым схемам относятся:
    переработка барды с получением сухой барды или кормовой добавки DDGS;
    переработка барды с получением кормовых дрожжей;
    переработка барды с использованием метанового брожения и получения газа метана [Ненайденко,2008].
     Интерес к использованию белковой и полисахаридной фракций барды растет, поскольку они могут использоваться как функциональная диетическая добавка для лечения кишечных расстройств, либо как альтернативный источник белка и углеводов в рационе животных [Новик с соавт., 2007].
     Барда зерновая используется в натуральном  виде при откорме сельскохозяйственных животных и птиц, а также при  производстве сбалансированных кормопродуктов. Образуется зерновая барда в виде жидкой суспензии от светло-желтого до темно-коричневого цвета.
     Зерновая  барда, получаемая на спиртовых заводах, перерабатывающих различное зерновое сырье, содержит различные питательные  компоненты (таблица 2) и является ценным питательным белково-углеводным продуктом (таблица 3). Образуется зерновая барда в количестве 120.0 – 148.0 м3/1000дал спирта с содержанием сухих веществ 5.8 – 9.0%.
     Таблица 2
     Органолептические и физико-химические показатели барды
Показатель       Результаты  анализа сушеной барды
пшеничной кукурузной
Массовая  доля, % влаги
протеина
клетчатки
жира
золы
крахмала
сахара
кальция
фосфора
 
7.90 30.20
5.10
9.45
6.23
1.25
3.27
0.07
1.05
 
9.00 27
9.10
4.55
-
-
-
0.14
0.66
Токсичность не установлено не токсично
Витамины, тыс. МЕ / кг A
D
E
 
 
4.50 -
18.8
 
 
- -
-
Витамины  группы В, мг / кг В1
В2
В4
В5
 
 
7.30 34
170
72
 
 
- -
-
-
Обменная  энергия для свиней, МДж / кг
для птицы, ккал / кг
 
9.70 2280
 
- -
 
     Таблица 3
     Содержание  веществ барды
Наименование  показателей Характеристика
1. Внешний  вид Суспензия
2. Массовая доля сухих растворимых веществ, % 3.6-5.0
3.Массовая  доля общих сухих веществ, % 5.8-9.0
4.Массовая  доля сырого протеина в пересчете  на абсолютно сухое вещество, % 22.0-30.0
5.Активная  кислотность рН, в ед. 3.6-5.0
 
     Послеспиртовую  барду можно использовать для культивирования микромицетов рода Trichoderma. В настоящее время для культивирования грибов, как правило, используются среды, полученные путем экстрагирования зерна злаков. Приготовление таких сред требует много времени и финансовых затрат. А послеспиртовая барда - это дешевый отход спиртового производства, не требующий больших затрат для использования в качестве культуральной среды грибов Trichoderma для биосинтеза ферментов.

     ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

     2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

     2.1 Использованные  изоляты

     В работе были использованы штаммы грибов рода T. citrinoviride 207, 207(1), 207(2), выделенные из почвы Больше-Кляринского городища Камско-Устьинского района РТ.

     2.2 Питательные среды, для культивирования микроорганизмов

     Картофельно-глюкозный  агар (КГА) (г/л):
     отвар картофеля – 200, глюкоза – 20, агар – 20.
     Послеспиртовая  барда.

     2.3 Культивирование грибов на послеспиртовой барде

     Для культивирования грибов использовали отход спиртового производства –  осаждённую послеспиртовую барду с добавками:
    КН2РО4 (15 г/л) – фосфаты необходимы для cинтеза нуклеиновых кислот, АТФ, которые в свою очередь нужны для обеспечения процесса роста и энергообеспечения Trichoderma,
    (NH4)2SO4 (4.8 г/л) – источник азота, который необходим для синтеза белка,
    СаСl2 (0.3 г/л) – из литературы известно, что дефицит Ca2+ негативно влияет на жизнедеятельность Trichoderma,
    МgSO4*7H2O (0.3 г/л) – Mg2+ необходим для работы ДНК- полимеразы,
    Мочевина (4.8 г/л) – дешёвый источник азота,
    Целлюлоза – индуктор синтеза ксиланаз,
    Tween – эмульгатор, увеличивает проницаемость клеточных стенок и ускоряет выход ферментов в раствор, предотвращает коагуляцию белка.
     Корректировку рН в диапазоне 4.0-6.5 проводили соляной кислотой или раствором аммиака.
     Культивирование проводили в колбах объёмом 250 мл, в каждую наливали по 50 мл среды. Затем в каждую колбу добавляли целлюлозу – 5 г/л и Тween 80 – 2 г/л. Затем автоклавировали при 120?С в течении 40 минут.
     Культуры  грибов для инокуляции выращивали на скошенном картофельно-глюкозном агаре в пробирках. Инокуляцию проводили следующим образом: делали смыв со скошенного агара 8 мл стерильной воды. В каждую колбу добавляли 150 мл инокулята на литр барды.
     Культивирование осуществлялось при 28°С, 130 об/мин (LOIP LS 110, устройство перемешивающее). Отбор проб проводили каждые 24 часа. Длительность культивирования составляла 7 суток.

     2.4. Определение ксиланазной активности

     Исследование  проводили в двух повторностях. Разбавленный образец в количестве 0.06 мл помещали в пробирку. Пробирку помещали на 5 минут в 50°С на водяную баню. Добавляли 0.6 мл субстрата и перемешивали. Через 20 минут инкубация прерывалась добавлением 0.3 мл раствора динитросалициловой кислоты (DNSA) [Konig et al., 2002].
     Субстрат  для исследования активности ксиланаз готовили следующим образом, 750 мг ксилана (Sigma X0502) помещали в 40 мл ацетатного буфера. Растворяли ксилан перемешиванием на кипящей водяной бане в течение 5 минут. После охлаждения до комнатной температуры рН раствора доводили 25% HCl до 5.0. Объем раствора доводили до 50 мл ацетатным буфером.
     Для построения калибровочного графика  стандарты ксилозы помещали в 0.06 мл ацетатного буфера в пробирку. Образцы  не инкубировали при 50°С, а сразу добавляли DNSA.
     После окончания описанной процедуры  для образцов и стандартов растворы в пробирках центрифугировали, отделяли надосадочную жидкость. Полученный раствор инкубировали точно 10 минут в кипящей водяной бане, затем охлаждали в ледяной бане 5 минут, добавляли 3 мл воды и перемешивали. Измерение проводили при 540 нм, используя спектрофотометр Shimadzu UV-1800, Япония. Одна единица активности энзима (IU) соответствует количеству фермента, вызывающего выход одного мкМоля восстанавливающих сахаров в минуту при гидролизе соответствующего субстрата. Выход восстанавливающих сахаров определяли по калибровочным графикам, построенным по ксилозе, соответственно. Для расчета применяли следующую формулу:
      
, где

     IU – активность фермента в международных единицах;
     РВ1 и РВ– редуцирующие вещества после и до ферментолиза, соответственно;
     D – разбавление фермента перед внесением в реакционную смесь;
     Н – дозировка препарата, мл;
     20 – время ферментолиза, мин.
     Специфическую активность рассчитывали как отношение  ксиланазной активности к общему количеству биомассы.
     Среднюю удельную скорость накопления ферментов (e,час-1) по аналогии с удельной скоростью роста определяли по формуле:
      
, где

     А– величина активности ферментов в начале отрезка времени;
     А– в конце отрезка времени.
     Общую активность фермента рассчитывали по формуле:
      
, где

     IUобщ – общая активность;
     V – обьем раствора.

     2.5 Анализ редуцирующих сахаров

     Анализ  проводили следующим образом: к 120 мкл исследуемой пробы добавляли 1200 мкл дистиллированной воды и 600 мкл DNSA. Ставили пробы на 10минут в водяную баню при 100°С, затем на 5 мин. В ледяную баню. После этого добавляли во все пробы по 6 мл дистиллированной воды и измеряли оптическую плотность при 540 нм (Shimadzu UV-1800, Япония). В качестве контроля использовали дистиллированную воду вместо пробы.
и т.д.................


Перейти к полному тексту работы


Скачать работу с онлайн повышением уникальности до 90% по antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru


Смотреть полный текст работы бесплатно


Смотреть похожие работы


* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.