На бирже курсовых и дипломных проектов можно найти образцы готовых работ или получить помощь в написании уникальных курсовых работ, дипломов, лабораторных работ, контрольных работ, диссертаций, рефератов. Так же вы мажете самостоятельно повысить уникальность своей работы для прохождения проверки на плагиат всего за несколько минут.

ЛИЧНЫЙ КАБИНЕТ 

 

Здравствуйте гость!

 

Логин:

Пароль:

 

Запомнить

 

 

Забыли пароль? Регистрация

Повышение уникальности

Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp», которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение уникальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения уникальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии и при повышении уникальности не вставляет в текст скрытых символов, и даже если препод скопирует текст в блокнот – не увидит ни каких отличий от текста в Word файле.

Результат поиска


Наименование:


курсовая работа Основные направления современной гистологии, их методы исследования

Информация:

Тип работы: курсовая работа. Добавлен: 17.08.2012. Сдан: 2012. Страниц: 8. Уникальность по antiplagiat.ru: < 30%

Описание (план):


                                                    ОГЛАВЛЕНИЕ 

Введение                                                                                                              4
Глава 1. Методы микроскопирования гистологических препаратов            5
        1.1. Световая микроскопия                                                                      5
          1.1.1 Ультрафиолетовая микроскопия                                                    5
          1.1.2 Люминесцентная, или флуоресцентная, микроскопия                6
          1.1.3 Фазово-контрастная микроскопия                                                 6
          1.1.4 Микроскопирование в темном поле                                               7
          1.1.5 Интерференционная микроскопия                                                 7
          1.2 Поляризационная микроскопия                                                         8
          1.2.1 Электронное микроскопирование                                                  8
         1.2.1.1 Метод замораживания – скалывания                                          8
          1.2.1.2 Метод криоэлектронной микроскопии                                       9
          1.2.1.3 Метод «замораживание-травление»                                            9
          1.2.2 Метод сверхвысокой микроскопии                                                9
          1.2.2.1 Рентгеноструктурный анализ                                                      10
          1.2.3 Методы контрастирования солями тяжелых металлов               10
Глава 2. Методы исследования фиксированных клеток и тканей. Гистологические красители                                                                              11
Глава 3. Методы исследования химического состава и метаболизма клеток и тканей                                                                                                                   20
           3.1 Гисто - и иммуноцитохимические методы                                      20
           3.2 Методы иммунофлюоресцентного анализа.
           Применение антител                                                                                20
           3.3 Метод радиоавтографии                                                                    21
Глава 4. Методы качественного и количественного химического анализа гистологических структур                                                                                 23
          4.1 Цитоспектрофотометрия                                                                   23
          4.2 Дифференциальное центрифугирование                                         23                
          4.3 Цитоспектрофлюориметрия                                                              23
          4.4 Интерферометрия                                                                               24
          4.5 Автоматизированные системы обработки  изображений                24   Заключение                                                                                                          25
Список  литературы                                                                                             26 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

ВВЕДЕНИЕ
      Гистология (от греч. histos — ткань, logos — учение) — наука о строении, развитии и жизнедеятельности тканей животных организмов.
      В гистологии имеется несколько разделов, изучающих определенные уровни организации живой материи, начиная с клеточного и заканчивая органным и системным уровнями, составляющим организм.
      Гистология относится к морфологическим наукам. В отличие от анатомии, изучающей строение органов на макроскопическом уровне, гистология изучает строение органов и тканей на микроскопическом и электронно-микроскопическом уровне. При этом подход к изучению различных элементов производится с учетом выполняемой ими функции. Такой метод изучения структур живой материи называется гистофизиологическим, и гистология нередко именуется гистофизиологией.                                 При изучении живой материи на клеточном, тканевом и органном уровнях рассматриваются не только форма, размеры и расположение интересующих структур, но методами цито- и гистохимии определяется химический состав веществ, образующих данные структуры. Изучаемые структуры также рассматриваются с учетом их развития, как во внутриутробном периоде, так и на протяжении начального онтогенеза. Именно с этим связана необходимость включения в гистологию эмбриологии.
      Задачей гистологии как науки является выяснение закономерностей строения различных тканей и органов для понимания протекающих в них физиологических процессов и возможности управления этими процессами.
      Основным методом исследования в гистологии является микроскопирование – изучение гистологических препаратов под микроскопом. В последнее время микроскопия сочетается с другими методами – гистохимией и гисторадиографией. Для микроскопии используют различные конструкции микроскопов, позволяющие изучать различные параметры гистологических препаратов. 

ГЛАВА 1. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
      Микроскопия может быть световая (с использованием светового микроскопа) и электронная (с использованием электронного микроскопа). Световая микроскопия может осуществляться в проходящем свете, когда свет проходит через тонкий прозрачный гистологический препарат, или же в отраженном свете, когда исследуют, например, толстый или непрозрачный объект. Аналогичным образом, электронная микроскопия может быть трансмиссионной, когда пучок электронов проходит сквозь изучаемый ультратонкий срез, или же растровой, или сканирующей, когда пучок электронов отражается от поверхности исследуемого объекта. В первом случае электронный микроскоп называется трансмиссионным (ТЭМ), а во втором – сканирующим (СЭМ). 

1.1 СВЕТОВАЯ  МИКРОСКОПИЯ 

      Основным методом гистологического исследования клеток, тканей и органов является световая микроскопия. В световом микроскопе для освещения объекта используются лучи видимого спектра. Современные световые микроскопы позволяют получать разрешение порядка 0,2 мкм (разрешающая способность микроскопа — это то наименьшее расстояние, при котором две рядом расположенные точки видны как отдельные). Разновидности световой микроскопии — фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная, темнопольная и др. 

1.1.1 УЛЬТРАФИОЛЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ 

      Метод изучения клеток с помощью микроскопов, в которых для освещения объекта используют ультрафиолетовые лучи (длина волны которых равна 210-275 нм). Такие микроскопы имеют большую, чем обычные световые микроскопы, разрешающую способность. Для наблюдения за объектом требуется специальная аппаратура — электронно-оптический преобразователь, который предохраняет орган зрения от действия ультрафиолетовых лучей.
      В ультрафиолетовом микроскопе используют более короткие ультрафиолетовые лучи с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь в 2 раза меньше, чем в обычных световых микроскопах, и составляет приблизительно 0,1 мкм. Полученное в ультрафиолетовых лучах невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь). 

1.1.2 ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ, ИЛИ ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ, МИКРОСКОПИЯ 

      Метод гистологического анализа с помощью люминесцентного микроскопа, в котором используется явление люминесценции (свечения) веществ при действии на них коротковолновых лучей (ультрафиолетового света, рентгеновских лучей). Некоторые биологические соединения, присутствующие в клетках, характеризуются спонтанной флюоресценцией при попадании на клетку ультрафиолетовых лучей. Для выявления же большинства других соединений клетки обрабатываются специальными флюорохромами (флюо-ресцеином, акридином оранжевым, корифосфином) (рис.1). С помощью флюорохромов исследуют, например, содержание в клетках нуклеиновых кислот. При окраске акридином ДНК дает красно-зеленое свечение, а РНК — оранжевое.
      Люминесцентный микроскоп широко используется также для изучения иммунофлюоресценции. Иммунофлюоресценция позволяет исследовать в клетке содержание очень малых количеств белка. Препарат предварительно обрабатывают антителами к исследуемому белку, меченными флюоресцирующим красителем. 


Рис.1 Флюорохромы 

1.1.3 ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ МИКРОСКОПИЯ 

      Метод изучения клеток в световом микроскопе, снабженном фазово-контрастным устройством. Благодаря смещению фаз световых волн в микроскопе такой конструкции повышается контрастность структур исследуемого объекта, что позволяет изучать живые клетки.    
      Служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Для изучения препаратов в обычном световом микроскопе необходимая контрастность структур достигается с помощью окрашивания. Метод фазового контраста обеспечивает необходимую контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе (рис.2). Такая конструкция оптики микроскопа дает возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения. Повышение контраста позволяет видеть все структуры, различающиеся по показателю преломления.
      Разновидностью метода фазового контраста является метод фазово-темнопольного контраста, дающий негативное по сравнению с позитивным фазовым контрастом изображение. 

 

Рис.2 Устройство для наблюдения методом фазового контраста КФ-4 

1.1.4 МИКРОСКОПИРОВАНИЕ  В ТЕМНОМ ПОЛЕ 

      В темнопольном микроскопе только свет, который дает дифракцию структур в препарате, достигает объектива. Происходит это благодаря наличию в микроскопе специального конденсора, который освещает препарат строго косым светом; лучи от осветителя направляются сбоку. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Разрешение этого микроскопа не может быть лучше, чем у светлопольного микроскопа, так как используется такая же длина волны. Но здесь достигается больший контраст. Он используется для изучения живых объектов, авторадиографических объектов, например зерен серебра, которые выглядят светлыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет, в частности treponema pallidum, вызывающей сифилис и др. 

1.1.5. ИНТЕРФЕРЕНЦИОННАЯ  МИКРОСКОПИЯ 

     Разновидностями фазово-контрастного микроскопа являются интерференционный микроскоп, который предназначен для
количественного определения массы ткани, и дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского), который специально используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.
     В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.
      Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучать живые клетки. В них используется эффект интерференции, возникающий при комбинации двух наборов волн, который создает изображение микроструктур. Преимуществом фазово-контрастной, интерференционной и темнопольной микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микрокиносъемки. 

1.2 ПОЛЯРИЗАЦИОННАЯ  МИКРОСКОПИЯ 

      В микроскопах этого типа световой пучок разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Проходя через структуры ткани со строгой ориентацией молекул, лучи запаздывают друг относительно друга вследствие неодинакового их преломления. Возникающий при этом сдвиг фаз является показателем двойного лучепреломления клеточных структур (таким способом были исследованы, например, миофибриллы). 

1.2.1 ЭЛЕКТРОННАЯ  МИКРОСКОПИЯ 

      В электронных микроскопах (рис.3) используют пучок электронов, длина электромагнитной волны которых в 100 000 раз короче длины волны видимого света. Разрешающая способность электронного микроскопа в сотни и тысячи раз превышает обычные оптические приборы и равна 0,5-1 нм, а современные мегавольтные электронные микроскопы дают увеличение до     1 000 000 раз. С помощью электронных микроскопов получены многочисленные данные об ультраструктуре клеток. Разновидностью электронной микроскопии является сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), при которой изучаются поверхностные структуры клеток. 

1.2.1.1 МЕТОД  ЗАМОРАЖИВАНИЯ-СКАЛЫВАНИЯ 

      Применяется для изучения деталей строения мембран и межклеточных соединений. Для изготовления сколов клетки замораживают при низкой температуре (—160°С). При исследовании мембраны плоскость скола проходит через середину бислоя липидов. Далее на внутренние поверхности полученных половинок мембран напыляют металлы (платина, палладий, уран), изучают их с помощью ТЭМ и микрофотографии. 

1.2.1.2 МЕТОД  КРИОЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ 

      Быстро замороженный тонкий слой (около 100 нм) образца ткани помещают на микроскопическую решетку и исследуют в вакууме микроскопа при -160°С. 

Рис.3 Электронный микроскоп 
 

1.2.1.3 МЕТОД  «ЗАМОРАЖИВАНИЕ-ТРАВЛЕНИЕ» 

      Применяют для изучения внешней поверхности мембран клеток. После быстрого замораживания клеток при очень низкой температуре блок раскалывают лезвием ножа. Образующиеся кристаллы льда удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем участки клеток оттеняют, напыляя тонкую пленку тяжелого металла (например, платины). Метод позволяет выявлять трехмерную организацию структур. Таким образом, методы замораживания — скалывания и замораживания — травления позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них артефактов, вызываемых фиксацией. 

1.2.2 МЕТОД  СВЕРХВЫСОКОЙ МИКРОСКОПИИ
      Используют электронные микроскопы с ускоряющим напряжением до 3 000 000 В. Преимущество этих микроскопов в том, что они позволяют исследовать объекты большой толщины (1—10 мкм), так как при
высокой энергии электронов они меньше поглощаются объектом. Стереоскопическая съемка позволяет получать информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким разрешением (около 0,5 нм).
1.2.2.1 РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЙ  АНАЛИЗ 

      Для изучения структуры макромолекул на атомарном уровне применяют методы с использованием рентгеновских лучей, имеющих длину волны около 0,1 нм (диаметр атома водорода). Молекулы, образующие кристаллическую решетку, изучают с помощью дифракционных картин, которые регистрируют на фотопластинке в виде множества пятен различной интенсивности. Интенсивность пятен зависит от способности различных объектов в решетке рассеивать излучение. Положение пятен в дифракционной картине зависит от положения объекта в системе, а их интенсивность свидетельствует о его внутренней атомной структуре.
         
1.2.3 МЕТОДЫ  КОНТРАСТИРОВАНИЯ СОЛЯМИ ТЯЖЕЛЫХ  МЕТАЛЛОВ 

      Позволяют исследовать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы — ДНК, крупных белков (например, миозин). При негативном контрастировании изучают агрегаты макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые нити) [1]. 
 
 
 
 
 
 

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФИКСИРОВАННЫХ  КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ  КРАСИТЕЛИ 

      В современной гистологии, цитологии и эмбриологии применяются разнообразные методы исследования, позволяющие всесторонне изучать процессы развития, строения и функции клеток, тканей и органов.
      Главными этапами цитологического и гистологического анализа являются выбор объекта исследования, подготовка его для изучения в микроскопе, применение методов микроскопирования, а также качественный и количественный анализ изображений.
      Объектами исследования служат живые и мертвые (фиксированные) клетки и ткани, и их изображения, полученные в световых и электронных микроскопах.
      Основным объектом исследования являются гистологические препараты, приготовленные из фиксированных структур. Препарат может представлять собой мазок (например, мазок крови, костного мозга, слюны, спинномозговой жидкости и др.), отпечаток (например, селезенки, тимуса, печени), пленку из ткани (например, соединительной или брюшины, плевры, мягкой мозговой оболочки), тонкий срез. Наиболее часто для изучения используется срез ткани или органа. Гистологические препараты могут изучаться без специальной обработки. Например, приготовленный мазок крови, отпечаток, пленка или срез органа могут сразу рассматриваться под микроскопом. Но вследствие того, что структуры имеют слабый контраст, они плохо выявляются в обычном световом микроскопе, и требуется использование специальных микроскопов (фазово-контрастные и др.). Поэтому чаще применяют специально обработанные препараты: фиксированные, заключенные в твердую среду и окрашенные. 

      Приготовление гистологического препарата включает в себя следующие этапы: 

      1. Взятие материала – кусочка ткани или органа. При заборе материала необходимо выполнять следующие правила: 

1) забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, при возможности от живого объекта, чтобы как можно лучше сохранить структуру исследуемых клеток; 

2) забор  материала должен проводиться  острым инструментом, чтобы не  травмировать ткани; 

3) толщина  кусочка не должна превышать  5 мм, чтобы фиксирующий раствор  смог проникнуть на всю глубину  ткани; 

4) обязательно  необходимо произвести маркировку  кусочка, при этом указываются  наименование органа, номер животного  или фамилия человека, дата забора. 

      2. Фиксация материала. Данный этап проводится для того, чтобы остановить обменные процессы в клетке и сохранить ее от распада. Для этого взятый на исследование кусочек ткани погружают в фиксирующий раствор. Раствор может быть простым (спирт или формалин) и сложным (раствор Карнуа, фиксатор Цинкера). Фиксатор вызывает денатурацию белков и сохраняет структуру клеток в состоянии, близком к прижизненному. Фиксацию можно проводить также путем замораживания – охлаждением жидким азотом или струей углекислого газа. 

      3. Заливка кусочков ткани в уплотняющие среды (парафин, смолы) – или замораживание. Данный этап необходим для того, чтобы в последующем из исследуемой ткани можно было изготовить тонкий срез. 

      4. Приготовление срезов на микротоме (рис.4, рис.5, рис.6, рис.7) или ультрамикротоме с помощью специальных ножей. После этого срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной – монтируются на специальные сеточки. 


      Рис.4 Микротом санный МС-2:предназначен для получения срезов растительных и животных тканей, залитых в парафин или целлоидин 


      Рис.5 Микротом для парафиновых срезов МПС-2:предназначен для получения серийных срезов животной и растительной тканей, залитых в парафин. Применяется в медицине и биологии при морфологических исследованиях. 


      Рис.6 Микротом замораживающий МЗ-2:предназначен для получения срезов замороженных растительных и животных тканей 

     Микротом-криостат МК-25(рис.7) предназначен для получения срезов свежезамороженной ткани с целью экспресс-диагностики биопсии, взятой при операциях, а также для научно-исследовательских работ, связанных с изучением ферментных, антигенных и других белковых систем ткани. Является незаменимым аппаратом при ряде микроскопических исследований, для гистохимии ферментов, иммуноморфологии и т.п. С успехом применяется при срочных биопсийных исследованиях в ходе различных хирургических операций. В этом случае отпадает необходимость в предварительной фиксации тканей, поскольку фиксации подвергается получаемый срез, который благодаря небольшой толщине фиксируется быстро, что сокращает время всего исследования.

      Рис.7 Микротом-криостат МК-25 

      5. Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии). Перед окраской срезов необходимо удалить уплотняющую среду – выполнить депарафирование. С помощью окраски достигается контрастность изучаемых структур. Красители можно подразделить на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко применяются основные красители (гематоксилин) и кислые (эозин). Часто используются и сложные красители. 

      6. Просветление срезов в ксилоле и толуоле. Их заключают в смолы (бальзам и полистирол) и закрывают покровным стеклом. 

      После данных процедур препарат можно исследовать под световым микроскопом. Помещенные под стекло, срезы для светового микроскопа могут долго храниться и многократно использоваться. Для электронной микроскопии каждый срез используется только 1 раз, при этом он фотографируется, и изучение структур ткани производится по электронограмме.
     Если ткань имеет жидкую консистенцию (например, кровь, костный мозг), то препарат изготавливают в виде мазка на предметном стекле, который затем также фиксируется, окрашивается и изучается.
     Из ломких паренхиматозных органов изготавливают препараты в виде отпечатка органа, проводят разлом данного органа, затем к месту разлома прикладывают предметное стекло, на которое приклеиваются свободные клетки. После этого препарат фиксируется и изучается.
      Из некоторых органов (например, брыжейки, мягкой мозговой оболочки) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливают пленочные препараты путем растягивания или раздавления между двумя стеклами с последующей фиксацией и заливкой в смолы [2]. 

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ КРАСИТЕЛИ 

      Гистологические красители (по химической природе) подразделяют на кислые, основные и нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее употребительный краситель гематоксилин, который окрашивает ядра клеток в фиолетовый цвет, и кислый краситель — эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-желтый цвет. Избирательное сродство структур к определенным красителям обусловлено их химическим составом и физическими свойствами. Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными, а окрашивающиеся основными — базофильными. Например, цитоплазма клеток чаще всего окрашивается оксифильно, а ядра клеток – окрашиваются базофильно.
Структуры, воспринимающие как кислые, так и  основные красители, являются нейтрофильными (гетерофильными).
      Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для изучения под микроскопом в течение многих лет.
      Для электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротоме, помещают на специальные сетки, контрастируют солями урана, свинца и других металлов, после чего просматривают в микроскопе и фотографируют. Полученные микрофотографии служат объектом изучения наряду с гистологическими препаратами [2]. 

    Характеристика  красителей
    Альциановый синий

      Краситель для микроскопических препаратов. Обеспечивает элективное выявление муцинов (кроме муцина поверхностного эпителия желудка человека) и кислых гликозаминогликанов в парафиновых и целлоидиновых срезах и цитологических препаратах. Реагент не содержит этанола и метанола. Может быть использован как без докраски другими красителями, так и в сочетании с ядерными красителями – гематоксилином Гарриса и квасцовым кармином, а так же перед постановкой ШИК-реакции. Возможно применение красителя после постановки иммуноцитохимических реакций при использовании диаминобензидинового хромогена.
    Гематоксилин-G (Джилла)

       Краситель для микроскопических препаратов. Обеспечивает визуализацию ядер клеток в срезах (парафиновых, криостатных, вибрoтомных, изготовленных на замораживающем микротоме) и цитологических препаратах. Реагент не содержит этанола и метанола. Предназначен для использования в качестве ядерного красителя при постановке иммуноцитохимических реакций в сочетании с различными типами хромогенов (в том числе и с растворимыми в этаноле) и для окраски гематоксилин-эозином. Краситель удобно использовать при автоматизированной окраске гистологических препаратов.
    Гематоксилин-H (Гарриса)

      Краситель для микроскопических препаратов. Обеспечивает визуализацию ядер клеток в срезах (парафиновых, криостатных, вибротомных, изготовленных на замораживающем микротоме) и цитологических препаратах.
Гематоксилин–Н (Гарриса)-БиоВитрум предназначен для  быстрой прогрессивной окраски  материала срочных биопсий, для  окраски гематоксилин-эозином и  для использования в качестве красителя ядер клеток при постановке иммуноцитохимических реакций в сочетании с различными типами хромогенов (в том числе и с растворимыми в этаноле).
и т.д.................


Перейти к полному тексту работы


Скачать работу с онлайн повышением уникальности до 90% по antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru


Смотреть полный текст работы бесплатно


Смотреть похожие работы


* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.