На бирже курсовых и дипломных проектов можно найти образцы готовых работ или получить помощь в написании уникальных курсовых работ, дипломов, лабораторных работ, контрольных работ, диссертаций, рефератов. Так же вы мажете самостоятельно повысить уникальность своей работы для прохождения проверки на плагиат всего за несколько минут.

ЛИЧНЫЙ КАБИНЕТ 

 

Здравствуйте гость!

 

Логин:

Пароль:

 

Запомнить

 

 

Забыли пароль? Регистрация

Повышение уникальности

Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp», которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение уникальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения уникальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии и при повышении уникальности не вставляет в текст скрытых символов, и даже если препод скопирует текст в блокнот – не увидит ни каких отличий от текста в Word файле.

Результат поиска


Наименование:


реферат Биосенсоры. Их настоящее и будущее

Информация:

Тип работы: реферат. Добавлен: 18.11.2012. Сдан: 2012. Страниц: 7. Уникальность по antiplagiat.ru: < 30%

Описание (план):


Министерство  образования и науки Украины
Национальный  Технический Университет
«Харьковский  Политехнический Институт»
 
Кафедра биотехнологии и аналитической  химии
 
 
Реферат
«Биосенсоры. Их настоящее и будущее»
 
 
 
 
Выполнила:
Студентка гр. О-57б
Войтенко  В.О.
Проверила:
Белых И.А.
 
 
 
 
 
Харьков, 2011
Содержание:
 
    Введение 
    Что такое биосенсор. Как работает биосенсор.
    Где применяются биосенсоры. Примеры применения
    Проблемы и перспективы развития
    Заключение
    Литература
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
                                  Введение
 
 
      Биологические  методы  позволяют   судить  о  присутствии   какого-либо
вещества  или его количественном  содержании  по  характеру и величине  его
воздействия   на   определенный   организм,   взятый    как    индикаторный.
Аналитическим   сигналом   при    этом    является    изменение    состояния
жизнедеятельности этого организма, то  есть  его  реакция  на  раздражитель,
которым, например, могут  быть  токсиканты  среды обитания  или какие-либо
другие биологически  активные  соединения,  вызывающие  нарушение  жизненных
функций индикаторного  организма или  его  гибель.  К  биологическим  методам
относят  и  биохимические  методы,  в  частности  ферментативные,  а   также
различные методики, например  индикаторные  трубки  на  основе  ферментов  и
других  биологических  материалов.   Интересно,   что   механизм   получения
информации  о составе какого-либо объекта  с помощью этих методов и  устройств
моделирует  процесс в живой природе, что  особенно важно при анализе  объектов
биологического  происхождения.
      Известно, что ферменты - это  биологические   катализаторы,  обладающие
ярко выраженной способностью избирательно катализировать  многие  химические
превращения как в живой клетке, так и вне организма. Замечательные свойства
ферментов  давно  привлекали  внимание  исследователей,  в   том   числе   и
аналитиков,   но   практическому   применению   ферментов,   например    для
аналитических целей, препятствовали прежде всего малая доступность чистых
ферментов, неустойчивость во времени их растворов, препаратов  при  хранении
и  воздействии   на   них   различных   факторов   (тепловых,   химических),
невозможность  многократного  использования  одной  порции  фермента   из-за
сложности отделения  его от других компонентов  раствора,  высокая  стоимость
очищенных препаратов.  Однако  выход  из  положения  вскоре  был  найден,  и
появилась возможность  использования каталитических свойств  ферментов вне  их
связи с  живым  организмом  и  возможность  сохранения  этой  способности  в
течение длительного  времени практически без  изменения.  Достижения  в  этой
области биохимии и  энзимологии  дали  начало  развитию  нового  направления
аналитической  химии  -  безреагентных  методов   анализа,   основанных   на
использовании различных биохимических сенсоров.
 
 
 
 
 
 
 
 
Что такое  биосенсор
 
 
      Под  термином  "биосенсор"  следует понимать  устройство,  в котором
чувствительный  слой, содержащий  биологический  материал:  ферменты,  ткани,
бактерии, дрожжи, антигены / антитела, липосомы, органеллы, рецепторы,  ДНК,
непосредственно  реагирующий  на   присутствие   определяемого   компонента,
генерирует   сигнал,   функционально   связанный   с   концентрацией   этого
компонента.  Конструктивно  биосенсор  представляет  собой   комбинированное
устройство,  состоящее  из  двух  преобразователей,  или  трансдьюсеров,   -
биохимического и физического, находящихся в тесном контакте друг  с другом.
Биохимический  преобразователь,  или   биотрансдьюсер,   выполняет   функцию
биологического  элемента распознавания, преобразуя определяемый компонент,  а
точнее, информацию о химических связях в физическое или химическое  свойство
или сигнал, а физический преобразователь это  свойство  фиксирует  с  помощью
специальной аппаратуры. В  данном  случае  реализуется  принципиально  новый
способ  получения  информации  о  химическом  составе  раствора.  Наличие  в
устройстве  биоматериала  с  уникальными  свойствами  позволяет  с   высокой
селективностью  определять нужные соединения в сложной  по составу  смеси,  не
прибегая  ни к каким дополнительным  операциям,  связанным  с  использованием
других  реагентов,  концентрированием  и  т.  д.  (отсюда   и   название   -
безреагентные методы анализа).
      Существует    большое    разнообразие    физических     трансдьюсеров:
электрохимические,  спектроскопические,   термические,   пьезоэлектрические,
трансдьюсеры на поверхностных акустических волнах и т.п. В настоящее время
наибольшее  распространение получили электрохимические  преобразователи.  Одни
из  них  генерируют  потенциал  на  специальном  электроде,  на  поверхность
которого  нанесен слой  биоматериала,  другие  генерируют  электрический  ток
реакции  продукта  превращения   определяемого   вещества   на   поверхности
электрода, вызванного биоматериалом. Другими  словами,  существуют  потенцио-
и амперометрические  биосенсоры. Если физический  преобразователь использует
изменение светопоглощения в области биослоя, то такой биосенсор  называется,
например, оптоволоконным, поскольку  измеряемый  сигнал  будет  передаваться
измерительному  прибору по оптическому  волокну.  Соответствующий  физический
преобразователь по аналогии с  электродом  называют  оптродом.  По  названию
преобразователя  можно  сделать  вывод  о  характере  физического  свойства,
которое измеряется аппаратно,  причем,  как  правило,  при  таком  измерении
используется  микропроцессорная  техника,  позволяющая  сделать   устройство
достаточно  компактным.
      Первое упоминание об аналитических  устройствах на основе ферментов  или
ферментсодержащих материалов появилось сравнительно недавно,  в 60-х годах
нашего столетия. Затем в обиход вошло понятие "биосенсор" или "биочип".  Это
важное событие  в науке. Здесь отражаются глубокие причины, связанные  с  так
называемыми интеграционно-синтетическими процессами в науке,  приводящими к
появлению   новых   знаний.   Функционально,   таким   образом,   биосенсоры
сопоставлены с датчиками живого  организма -  биорецепторами,  способными
преобразовывать все  типы  сигналов,  поступающих  из  окружающей  среды,  в
электрические.
 
 
 
                           Как работает биосенсор
 
 
      Принцип работы  биосенсора  достаточно  прост.  Определяемое  вещество
диффундирует  через полупроницаемую мембрану в тонкий  слой  биокатализатора,
в котором и протекает ферментативная  реакция.  Поскольку в данном  случае
продукт  ферментативной  реакции  определяется  с  помощью   электрода,   на
поверхности которого закреплен фермент, то  такое устройство  еще называют
ферментным  электродом. Таким образом, определения "биосенсор" и "ферментный
электрод" в данном случае синонимы.
      Следует отметить,  что  характер  ферментативной  реакции  зависит   от
природы фермента, типа его каталитического действия. Среди  ферментов  можно
выделить    оксидоредуктазы,    осуществляющие    реакции    окисления     и
восстановления, гидролазы, катализирующие гидролиз, трансферазы,  вызывающие
перенос ацильных, гликозидных и т.п. остатков и т.д. Многие ферменты  сейчас
доступны, их чистые препараты включены в каталоги ряда  фирм-производителей.
Важно   отметить,   что   при    конструировании    биосенсора    увеличение
продолжительности действия фермента  становится  основной  задачей.  Дело  в
том,  что  нативный  фермент сохраняет свои  свойства   лишь   в   течение
относительно  короткого  времени.  Поэтому  была  разработана  операция  так
называемой  иммобилизации  фермента.  В   ходе   иммобилизации   с   помощью
специальных реагентов фермент "закрепляют" либо на поверхности  адсорбентов,
например силикагеля, угля или целлюлозы,  либо  вводят  в пленку  пористого
полимера, либо ковалентно, то есть с помощью химических связей,  "пришивают"
к  какой-либо  подложке.  При  этом  фермент  закрепляется,  перестает  быть
подвижным,  не  вымывается  из  биослоя,  а его   каталитическое   действие
сохраняется..   Как   видно,   при   иммобилизации   ферментов    используют
разнообразные  способы  их  закрепления,  в  том  числе  и  комбинированные.
Биосенсоры  могут быть  сконструированы  и по  так   называемой   объемной
технологии, при которой индивидуальные компоненты, составляют как бы  единый
физический  ансамбль. Хотя такие биосенсоры в настоящее время и применяются
на практике, они имеют недостатки, есть трудности  и при их  изготовлении.  В
самом  деле,  послойное покрытие   электрода   или   какого-либо   твердого
преобразователя  мембраной  должно  быть   воспроизводимо.   Соответствующая
технология   формирования   поверхности   должна    допускать    возможность
изготовления  достаточно миниатюрного электрода. Кроме  того,  биосенсоры  со
сравнительно  толстыми  мембранами  дают  в  итоге  большее  время  отклика,
имеются сложности  и при их градуировке. Успехи в  области  развития  средств
микроэлектроники  подтолкнули разработчиков конструкций  биосенсоров  к  новым
решениям. Оказалось  перспективным  использовать  так  называемую  планарную
технологию (фотолитографию, полупроводниковую  технику покрытий и т. д.),  по
которой можно  изготовить  так  называемый  биочип,  объединяющий  сенсорную
систему, трансдьюсер, аналого-цифровой преобразователь и микропроцессор  для
измерения аналитического сигнала и расчета результатов  анализа.  Хотя  такие
биочипы могут тиражироваться,  основной  проблемой в данном  случае  будет
являться  воспроизводимость состояния, то есть микроструктуры  поверхности с
нанесенным  слоем   биологически   активного   фермента.   Трудной   задачей
представляется  в данном случае и оптимизация  такой структуры  в  отличие  от
объемной  технологии,  реализованной  присутствием  в  конструкции  сенсорной
части нескольких молекулярных слоев. Тем не менее "молекулярный дизайн"  при
конструировании биосенсоров будущего может составить реальную  конкуренцию
объемному их варианту.
 
 
                          Где применяют биосенсоры
 
 
      По-видимому,  самым  распространенным  в  настоящее   время   является
амперометрический биосенсор на основе  иммобилизованной  глюкозоксидазы  для
определения сахара  в  крови.  Исторически  этот  биосенсор  является  самым
"древним". В настоящее время  для   определения  глюкозы  создано   наибольшее
число различных  биосенсоров,  что связано с необходимостью  контроля  за
содержанием  сахара  в  биологических  жидкостях,  например  в  крови,   при
диагностировании и лечении некоторых заболеваний,  прежде  всего диабета.
Схема функционирования биосенсора  на  глюкозу в принципе  типична и для
других  амперометрических  биосенсоров  с аналогичным  трансдьюсером.   Ток
восстановления  кислорода  на   платиновом   катоде   прямо   пропорционален
концентрации  кислорода. В присутствии субстрата (например, глюкозы в  крови,
взятой для анализа) ферментативная реакция понижает  концентрацию  O2.Таким
образом,   ток   восстановления   кислорода   уменьшается    пропорционально
концентрации  субстрата
      Преимущество данного  типа  биосенсора  состоит прежде  всего в  его
высокой селективности.  Избирательность  подобных  биосенсоров  определяется
высокой специфичностью глюкозоксидазы и природой электрохимической реакции,
в которой  участвуют  компоненты  ферментативного  процесса.  В целом класс
ферментов - оксидаз является высокоспецифичным  по отношению  к  определяемым
субстратам.  Системы  же   на   основе   небиологического   преобразователя,
напротив, не столь селективны, как этого бы хотелось, что обусловлено рядом
причин. Тем  не менее имеются ограничения и по применению данной  конструкции
биосенсора, обусловленные влиянием кислорода и других  посторонних веществ,
способных проникать через биослой (точнее, через мембрану), а потому  задача
совершенствования конструкций биосенсоров на глюкозу представляется  весьма
актуальной.
      Один  из  возможных  путей   такого  усовершенствования  заключается   в
следующем.  Если  изменить  полярность  включения электрода-трансдьюсера  в
глюкозном биосенсоре на противоположную, то есть  платиновый  катод сделать
анодом, то при  потенциале  +0,6В он становится  совершенно  нечувствительным
к кислороду, но зато дает отклик на пероксид водорода,  который при данном
значении потенциала окисляется до воды. Чувствительность такого электрода к
пероксиду водорода оказалась привлекательной, а поскольку вода  образуется
как продукт  ферментативной реакции, по его содержанию можно сделать вывод  о
концентрации,  например  глюкозы  в  различных   объектах.   Другой   способ
улучшения  селективности  биосенсоров  и устранения  помех от  посторонних
примесей   состоит   в   использовании   различных   мембран    -    пленок,
предотвращающих их попадание  непосредственно  на  электрод-преобразователь.
При этом  внутренняя  мембрана  выполняет  функцию  защиты  от  примесей,  а
внешняя мембрана пропускает субстрат в биослой. Однако необходимо  отметить,
что с  помощью  специальных  приемов,  называемых  химической  модификацией,
можно до такой  степени  изменить  свойства  поверхности  электрода,  что  он
будет  "глухим"  к  большинству  примесей  и,  напротив,  чувствительным   к
компонентам ферментативной реакции.
      Биосенсоры,  основанные  на  кислородном электроде   как   физическом
трансдьюсере, позволяют определять разнообразные субстраты ферментов:  кроме
глюкозы - лактаты, L-аминокислоты, салицилаты, оксалаты, пируваты,  то  есть
анионы  соответствующих  карбоновых  кислот.  В  литературе  описаны  другие
биосенсоры подобного типа, ряд которых применяется на практике.
      С помощью биосенсоров можно решить и обратную  задачу:  при  некоторой
определенной  концентрации   субстрата   оценивать   активность   собственно
фермента  по величине измеряемого сигнала    ( потенциала, тока и т. д.).  Из
описания  работы фермента следует, что измеряемый сигнал  зависит  не  только
от концентрации субстрата, но и от каталитической активности  биологического
преобразователя,  то  есть   фермента.   Такое   использование   биосенсоров
позволяет измерить активность большого числа ферментов,  например  в  крови.
Оценка активности ферментов, связанных  с  сердечной  деятельностью,  таких,
как  аспартамаминотрансфераза,  креатинкиназа,   позволяет   в   клинических
условиях оценивать глубину инфаркта миокарда. Измерения активности  фермента
амилазы используются в педиатрии.
 
 
                  Биосенсоры на основе других биоматериалов
 
 
      Многие ферменты дороги и быстро  теряют свою активность,  использование
выполненных  на  их  основе   биосенсоров   не   может   быть   экономически
целесообразным.   Поэтому    применение    бактерий,    микроорганизмов    и
биологических  тканей  различного   происхождения   более   предпочтительно,
поскольку  в  данном  случае  отпадает   необходимость   в   предварительном
получении и очистке ферментов. К существенным недостаткам таких  биосенсоров
можно отнести  низкую селективность определения  вследствие того,  что  клетки
живых  организмов  фактически  являются   источником   самых   разнообразных
ферментов. Помимо  этого  время  отклика  биосенсоров  на  основе  тканей  и
микроорганизмов может  быть  достаточно  большим,  что  также  уменьшает  их
практическую  ценность.  Тем  не  менее  в   последнее   время   наблюдается
повышенный  интерес к разработке конструкций  электродов, содержащих  не  сами
ферменты  в очищенном виде,  а  их  первозданные  источники  -  биологические
материалы. Так, было установлено, что тканевые  срезы  в  биосенсорах  могут
выполнять функцию  источников  каталитической  активности.  Например,  создан
биосенсор на аскорбиновую кислоту,  состоящий  из  платинового электрода и
пластины  кожуры огурца  или  тыквы,  служащей  источником  аскорбиноксидазы.
Активность  фермента в такой природной матрице  достаточна для проведения  50-
80 определений  аскорбиновой кислоты в различных  объектах.  Установлено,  что
пластины  биоматериала могут храниться без  потери активности в  течение  года
в 50%-ном глицерине.
      Аналогичный подход использовали  при создании конструкции биосенсора на
допамин - важнейший биогенный амин,  участвующий в регуляции деятельности
мозга. В  данном  биосенсоре  ткань плода банана  была  иммобилизована  на
поверхности кислородного электрода.  В  рассмотренных  случаях  биоматериалы
создают "естественное окружение" для ферментов, способствующее  стабилизации
их  активности.  Тканевые  материалы  достаточно  долго  сохраняют   высокую
специфичность,  что  очень  важно  для  биосенсора,  тогда как   выделенные
ферменты  в тех  же  условиях  быстро  разрушаются.  Известны  биосенсоры,  в
которых  использован цельный фрагмент  ткани   печени   быка,   являющийся
носителем фермента каталазы и  иммобилизованный  на  кислородном электроде.
Ферментативное  действие  каталазы,   проявляющееся   в   катализе   реакции
разложения  пероксида  водорода,  используют  в этом  случае  для создания
соответствующего  электрода. Разработан биосенсор на  основе  кожуры  кабачка
или огурца и кислородного электрода для  определения  L-аскорбиновой  кислоты
во фруктовых  соках, функционирующий  подобно аналогичному  типу  электрода,
уже рассмотренного выше.  Тем  не  менее,  несмотря  на  успехи  в  развитии
биосенсоров   на   основе   биологических    материалов,    надежность    их
функционирования  все еще  остается  спорной.  Еще  один  пример  конструкции
биосенсорного  устройства  относится к ферментному электроду на   основе
микроорганизмов - дрожжей,  помещаемых  между  двумя  пористыми  мембранами.
Биосенсор  на  основе  иммобилизованных  дрожжей и кислородного  электрода
позволяет определять этанол и метанол, например в промышленных стоках.
      Интерес представляют биосенсоры на основе иммобилизованных на мембране
микроорганизмов, служащих элементом так называемого микробного  сенсора.  В
качестве примера таких устройств можно упомянуть амперометрический сенсор
на аммиак (в  сточных  водах)  на  основе  иммобилизованных  нитрифицирующих
бактерий  и кислородного  электрода.  Такой  биосенсор  полезен при решении
вопросов  охраны  окружающей  среды,  и  в  частности  при  контроле  степени
очистки промышленных стоков.
      Можно отметить также использование  биосенсоров на  основе  гидролаз  -
ферментов,   являющихся    катализаторами    гидролитического    расщепления
субстратов.  Эти  биосенсоры  предназначаются,  как правило,  для эколого-
аналитического   контроля    остаточных    количеств    пестицидов    класса
фосфорорганических  соединений, а также для определения  некоторых  ОВ.  Если
при гидролизе  какого-либо субстрата  ферментом  класса  гидролаз  образуется
электрохимически   активное   соединение,   то,    контролируя    содержание
последнего, можно  контролировать  ферментативную  реакцию  так  же,  как  в
предыдущих  случаях. Однако в присутствии веществ,  являющихся  ингибиторами,
активность  фермента  уменьшается,  что   и   обнаруживается   по   сигналу,
регистрируемому  электродом.  Интересно отметить  высокую чувствительность
такого  определения:  эффект  изменения  активности  фермента  доступен  для
измерения уже  при действии ультраследовых количеств ингибитора -  на  уровне
пико- и фемтограмм.
 

Сенсор для определения  усваиваемых сахаров

 
При культивации микроорганизмов  на патоке сахарного тростника, содержащей различные сахара, для контроля процесса брожения важно определение суммарного содержания усваиваемых Сахаров  в среде. Так, при высокой концентрации сахара наблюдается подавление катаболизма, что приводит к подавлению роста клеток. Восстановленные сахара и сахарозу в культуральных средах можно определять феррицианидным методом. Этот метод, однако, не вполне надежен, поскольку неусваиваемые сахара могут мешать определению.
Усвоение органических соединений микроорганизмами можно оценивать  по дыхательной активности последних, которую в свою очередь можно  непосредственно измерить при помощи кислородного электрода.
Для непрерывного определения общего содержания усваиваемых Сахаров (глюкозы, фруктозы и сахарозы) в бродильной среде сконструирован микробный  сенсор, состоящий из иммобилизованных живых клеток. Общее содержание усваиваемых  Сахаров оценивали по потреблению  кислорода иммобилизованными микроорганизмами. Добавление аликвотной части глюкозы  приводило к увеличению поглощения кислорода в растворе. В результате электродный ток постепенно понижался, пока не достигал некоторого стационарного  значения. Время отклика сенсора  составляло 10 мин при измерении  стационарного тока и 1 мин в импульсном режиме. Существует линейная зависимость  между уменьшением тока и концентрацией  глюкозы (до 1 мМ), фруктозы (до 1 мМ) и сахарозы (до 0,8 мМ) соответственно. Чувствительность микробного сенсора к этим сахарам оценивается соотношением 1,00: 0,80: 0,92. При использовании растворов, содержащих 0,8 мМ глюкозы, относительное стандартное отклонение для величины уменьшения тока составляло 2%. Общее содержание усваиваемых Сахаров рассчитывали, суммируя значения аналитических сигналов для откликов на глюкозу, фруктозу и сахарозу, при этом разность истинных и расчетных концентраций не превышала 8%. Микробный сенсор помещали в бродильную среду для получения глутаминовой кислоты, где он надежно работал более 10 дней и выдержал 960 измерений.

 Глюкозный сенсор

 
Для определения глюкозы предложен  микробный сенсор, состоящий из иммобилизованных целых клеток Pseudomonas fluorescens и кислородного электрода. Сенсор помещали в исследуемый раствор, который во время измерений насыщали кислородом и перемешивали магнитной мешалкой.
 


 
На рис.2.4 показана типичная зависимость  сигнала сенсора от времени. При 30"С стационарный ток устанавливался в пределах 10 мин. Точное время отклика зависело от концентрации добавленной глюкозы. При удалении микробного сенсора из раствора и помещении в среду, не содержащую глюкозы, ток постепенно возрастал и возвращался к начальному уровню примерно за 15 мин при 30°С.
Сенсор проявляет слабую чувствительность к фруктозе, галактозе, манозе, сахарозе и не чувствителен к аминокислотам. Поэтому избирательность определения глюкозы при помощи этого микробного сенсора можно считать вполне удовлетворительной. При измерениях стационарного тока зависимость между током и концентрацией глюкозы линейна до концентрации 20 мг/л, причем нижняя граница определяемых концентраций глюкозы составляла 2 мг/л. При содержании глюкозы 10 мг/л значение тока воспроизводилось с точностью +6%. Стандартное отклонение составило 6,5 мг/л при числе опытов более 20.
Микробный глюкозный сенсор позволяет  определять концентрацию глюкозы в  патоке со средней относительной  погрешностью ±10%. Для сравнения  глюкозу определяли также ферментным методом; результаты коррелируют с полученными электрохимическим методом.

 Сенсор уксусной кислоты

 
При выращивании микроорганизмов  на уксусной кислоте как источнике  углерода избыток кислоты подавляет  их рост и, следовательно, ее оптимальную  концентрацию следует поддерживать с помощью непрерывного контроля в режиме "на линии".
Пористую мембрану с иммобилизованными  дрожжами закрепляли на поверхности  тефлоновой мембраны кислородного электрода и покрывали другой газопроницаемой тефлоновой мембраной. Таким образом, микроорганизмы помещались между двумя пористыми мембранами. Микробная сенсорная система состояла из проточной ячейки с водяной рубашкой, магнитной мешалки, перистальтического насоса, автоматического дозатора и самописца, регистрирующего ток.
Принцип работы этого сенсора аналогичен описанному выше. Поскольку ацетат-ионы не могут проходить через мембрану, рН пробы поддерживали существенно ниже рК уксусной кислоты (4,75 при 30°С). Что касается избирательности микробного сенсора по отношению к уксусной кислоте, то следует отметить, что он не чувствителен к таким летучим соединениям, как муравьиная кислота и метанол, или нелетучим компонентам питательной среды, таким, как глюкоза или фосфат-ионы. Tiichosporon brassicae могут потреблять пропионовую, н-бутановую кислоты и этанол, однако при ферментации эти вещества обычно отсутствуют либо их концентрация слишком мала, чтобы мешать определению уксусной кислоты.
Для сравнения концентрацию уксусной кислоты в бродильной среде для  производства глутаминовой кислоты определяли описанным микробным сенсором и методом газовой хроматографии. Наблюдается хорошее согласие результатов, полученных двумя методами: коэффициент корреляции равен 1,04 для 26 опытов. Выходной сигнал сенсора (0,29-0,25 мкА) был постоянен (с точностью до +10% от исходного значения) более трех недель, при этом было выполнено 1500 измерений. Теперь этот микробный сенсор выпускается в Японии серийно.

 Сенсор спиртов

 
В бродильных производствах необходимо непрерывно определять концентрации метанола и этанола в культуральных средах. При использовании спиртов в качестве источника углерода для культивируемых микроорганизмов концентрация спиртов должна поддерживаться на оптимальном уровне, чтобы избежать ингибирования субстратом. Как известно, спирты утилизируются многими микроорганизмами, следовательно, такие микроорганизмы можно использовать для конструирования спиртового сенсора [5].
Этанольный сенсор включает иммобилизованные Trichosporon brassicae и кислородный электрод. Способ иммобилизации клеток и конструкция электрода такие же, как в глюкозном сенсоре.
Для измерений этим сенсором в стационарных условиях требуется много времени, поэтому был использован импульсный метод, обеспечивающий отклик в течение  всего 6 мин. Линейная зависимость между  уменьшением тока и концентрацией  этанола наблюдается в диапазоне  концентраций от 2 до 22,5 мг/л. Для пробы  с концентрацией этанола 16,5 мг/л  разностный токовый сигнал воспроизводим  с относительной погрешностью 6%. Стандартное отклонение составило 0,5 мг/л при числе опытов, равном 40.
Сенсор не проявляет чувствительности ни к летучим соединениям, таким, как метанол, муравьиная, уксусная и пропионовая кислоты, ни к нелетучим веществам.
Микробный этанольный сенсор использовали в дрожжевых бродильных средах. Определение концентрации этанола в тех же пробах методом газовой хроматографии дало результаты, сравнимые с полученными при помощи микробного сенсора: коэффициент корреляции составил 0,98 при числе опытов более 20. В диапазоне концентраций этанола 5,5-22,3 мг/л выходной ток сенсора оставался постоянным более трех недель, в течение которых было проведено 2100 анализов. Сейчас этот сенсор выпускается в Японии серийно.

Цефалоспориновый сенсор

 
Антибиотики обычно определяют с помощью  турбидиметрического или титриметрического микробиологического анализа, однако методики такого определения довольно сложны и непригодны для экспрессных анализов.
Известно, что Citrobac'ter freundii вырабатывает фермент цефалоспориназу, который катализирует реакцию цефалоспорина с выделением протона:
 

 
Цефалоспориназа, однако, очень неустойчива и не подходит для изготовления ферментного сенсора. В сенсоре, чувствительном к цефалоспорину, можно использовать целые клетки Citrobacter freundii, которые иммобилизуют в коллагеновой мембране, помещаемой затем в мембранный реактор.
На рис.2.8 показана система для  непрерывного определения цефалоспоринов. Она включает реактор мембранного типа с прокладкой в середине. Измерения рН, обусловливаемые ферментативной реакцией, измеряли комбинированным стеклянным электродом и регистрировали с помощью самописца.
При введении в реактор растворов, содержащих различные количества цефалоспоринов, разность потенциалов на электродах постепенно увеличивалась, пока не достигала некоторого максимума. Минимальное время отклика системы зависело от скорости потока и активности иммобилизованных бактерий в коллагеновой мембране.
 

 
При скорости потока 2 мл/мин максимальная разность потенциалов достигалась  через 10 мин.
Получена линейная зависимость  между максимальной разностью потенциалов  и логарифмом концентрации цефалоспорина. С помощью цефалоспоринового раствора определяли 7-фенилацетиламидодезацетоксиспорановую кислоту (7-фенилацетил-ADCA), цефалоридин, цефалотин и цефалоспорин С.
Стабильность микробного сенсора  проверяли, анализируя раствор, содержащий 125 мкг/мл 7-фснилацетил-АОСА. Цефалоспорин определяли несколько раз в день, однако наблюдаемая разность потенциалов не менялась в течение недели.
Эту систему применяли также  для определения цефалоспорина С в культуральной среде Cephalosporium acremonium. Результаты измерений сравнивали с данными, полученными методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В случае микробного сенсора относительная погрешность составила 8%, следовательно, сенсор вполне пригоден для непрерывного определения цефалоспоринов в ферментационных средах.

Сенсор БПК

 
Биохимическое потребление кислорода (БПК) - один из часто используемых показателей  загрязнения органическими веществами. Обычно определение БПК требует  пятидневной инкубации, поэтому  необходим экспрессный метод  оценки БПК, дающий более воспроизводимые  результаты.
Насыщенный кислородом фосфатный  буферный раствор (0,01 М, рН 7) пропускали через проточную ячейку со скоростью 1 мл/мин. Когда измеряемый ток достигал стационарного значения, в ячейку вводили пробу со скоростью 0,2 мл/мин. Значение стационарного тока зависело от БПК анализируемого раствора. Затем ток постепенно возвращался к начальному уровню. Время отклика сенсора (время, требуемое для достижения стационарного тока) зависело от природы анализируемого раствора.
Линейная зависимость между  разностью токов (начального и стационарного  значений) и БПК, определяемого после  пятидневной выдержки в стандартном  растворе глюкозы и глутамината, наблюдалась до значения БПК 60 мг/л. Нижняя граница определяемых концентраций составляла 3 мг/л. При анализе раствора с БПК, равным 40 мг/л, ток воспроизводился с относительной погрешностью +6% (число опытов более 10).
Рассматриваемый микробный сенсор применяли для оценки пятидневного БПК необработанных сточных вод  бродильного производства. Пятидневное БПК сточных вод определяли также методом JIS (метод, рекомендованный Japanese Industrial Standard Committee). Значения БПК, оцененные микробным сенсором и определенные методом JIS, хорошо коррелировали между собой. С помощью данного сенсора оценивали также БПК необработанных промышленных сточных вод различных типов. Найдено, что сигнал сенсора определяется соединениями, присутствующими в сточных водах.

Основные биосенсоры на основе растительных и животных тканей

 
Тканевые материалы растительного  и животного происхождения успешно  используют в качестве биокаталитических компонентов биосенсоров. Биокаталитические материалы этого класса просто создают естественное окружение для представляющего интерес фермента, в результате чего требуемая ферментативная активность заметно стабилизируется. Во многих случаях тканевые биосенсоры служат намного дольше, чем аналогичные биосенсоры с выделенными ферментами. Кроме того, тканевые материалы сохраняют достаточно высокую специфическую активность, необходимую для конструирования некоторых биосенсоров, тогда как выделенные ферменты в тех же условиях разрушаются. В большинстве случаев эти преимущества достигаются не в ущерб избирательности. Если же в тканевом материале протекают мешающие процессы, разрабатывают специальные меры по увеличению избирательности. В этой главе достоинства тканевых биосенсоров показаны на конкретных примерах. Рассмотрено также несколько биосенсоров на основе таких биокаталитических материалов, как фрагменты животных клеток. Наконец, впервые предложены возможные механизмы транспорта (вход, внутренний перенос и выход) субстрата и продуктов в иммобилизованных клетках ткани.
Исторически тканевые биосенсоры появились позже рассмотренных в предыдущих главах ферментных и микробных биосенсоров. Возможность использования цельного фрагмента ткани млекопитающих в качестве биокаталитического слоя впервые была продемонстрирована на примере аргининового сенсора. Тонкий слой бычьей печени и соответствующее количество фермента - уреазы совместно иммобилизовали на поверхности аммиачного газочувствительного датчика. На кончике сенсора протекали каталитические реакции. 

 
Разработка этого первого сенсора  на основе ткани печени быка открыла  путь к созданию тканевых биосенсоров.

 Биосенсор АМР

 
Тканевые материалы не только удлиняют срок службы биосенсора, но и обеспечивают большую концентрацию заданного биокатализатора. Примером может служить рассматриваемый в этом разделе биосенсор AMP с газоаммиачным датчиком. Ограниченная площадь поверхности датчика не позволяет иммобилизовать большие количества ферментного препарата. Поэтому если специфическая активность последнего невысока, то и аналитические характеристики сенсора будут неудовлетворительными. Эффект низкой концентрации фермента проявился, в частности, в случае ферментного АМР-электрода, описанного в работе. Используемый в этом сенсоре выделенный фермент обычно имеет низкую активность, что приводит к малой величине наклона градуировочных кривых и короткому сроку службы. Чувствительность и срок службы сенсора AMP можно значительно улучшить при помощи тонкого слоя мышечной ткани кролика. Повышение чувствительности биосенсора непосредственно связано с пятикратным увеличением активности биокатализатора на поверхности датчика.
Выделенный фермент иммобилизуют на поверхности датчика с помощью  диацетилцеллюлозной мембраны. В тканевом биосенсоре тонкий слой мышечной ткани кролика удерживают на датчике найлоновой сеткой с отверстиями размером 37 мкм. Сенсоры обоих типов хранят при комнатной температуре в рабочем буферном растворе, содержащем 0,1 М ТрисНС1, 0,1 М КС1 и 0,02% азида натрия (рН 7,5). После сборки тканевый биосенсор следует выдерживать от 2 до 4 ч для удаления фонового аммиака.
Чтобы улучшить аналитический сигнал тканевого АМР-сенсора, оптимизировали различные параметры эксперимента (рН, концентрацию ионов калия, температуру и толщину слоя ткани). Найденные оптимальные условия-рН 7,5, 0,1 М К+ и 25°С. Увеличение толщины ткани приводит к большим временам отклика, которые становятся неприемлемыми при толщине слоя больше 0,81 мм. С другой стороны, кусочки ткани толщиной меньше 0,5 мм неудобны в обращении и плохо воспроизводимы. По этим причинам для изготовления сенсора используют слои ткани толщиной от 0,5 до 0,8 мм, которые можно легко получить с помощью острого лезвия бритвы.
Слой мышечной ткани кролика  толщиной 0,5 мм содержит приблизительно пять международных единиц АМР-деаминазной активности. В то же время сравнимый объем (25 мкм) коммерческого препарата фермента имеет активность всего 0,1 ед. Такая низкая активность и приводит к плохой чувствительности ферментных биосенсоров. Фактически перед иммобилизацией выделенный фермент приходится концентрировать фильтрацией в течение 16 ч и в результате активность ферментного слоя на поверхности электрода повышается до 0,9 ед. [35]. Но даже после такого концентрирования ферментативная активность в слое ткани остается выше примерно в пять раз. Часто бывает трудно найти надежный источник приобретения некоторых видов млекопитающих для получения специфического тканевого материала. В таких случаях в качестве биокатализатора удобнее использовать порошок из высушенной ацетоном ткани. Первая попытка такого рода описана в сообщении о биосенсоре AMP, в котором пасту из растертой в порошок обезвоженной ацетоном мышцы кролика физически закрепляли на поверхности аммиачного датчика [4].
Пасту из растертой в порошок  мышцы кролика получают следующим  образом. В пластиковую пробирку (1 мл) вводят 300 мкл буферного раствора, содержащего 0,1 М Трис-НС1, 0,1 М КО и 0,02% азида натрия (рН 7,9), и добавляют 100 мг замороженного порошка. Смесь перемешивают на вихревой мешалке в течение 30 с. При такой обработке получается однородная паста, необходимое количество которой (обычно 10 мг) наносят на тефлоновую мембрану аммиачного датчика. Поверх пасты помещают диацетилцеллюлозную мембрану и завинчивают колпачок электрода до положения, при котором паста прочно удерживается на месте. Собранный биосенсор оставляют вымачиваться на ночь в указанном выше буферном растворе для удаления фонового аммиака из биокаталитического слоя.

 Биосенсор мочевины

 
Здесь описан биосенсор для определения мочевины, а котором в качестве биокаталитического компонента используют слой муки из бобов канавалии мечевидной. Эта мука исходно содержит большое количество фермента уреазы, который катализирует реакцию
 

 
Этот биокаталитический материал оказался удачным заменителем чистого фермента.
Рассматриваемый биосенсор готовят следующим образом. С целого боба канавалии мечевидной удаляют наружный слой и измельчают семя с помощью ступки и пестика. Свежеприготовленную муку (обычно 7 мг) наносят на поверхность газоаммиачного датчика и смешивают с небольшим объемом буферного раствора (0,2 М Трис-HCl, рН 8,5, 0,1 мМ ЭДТА). Полученную таким способом пасту равномерно размазывают по мембране датчика и добавляют глутаровый альдегид, чтобы связать белки. В результате получается стабильный биокаталитический слой. Градуировочные кривые обычно получают в буферном растворе, содержащем Трис-HCl и ЭДТА при 25°С. Биосенсоры хранят в том же растворе при комнатной температуре.
Как видно из табл.3.7, основные характеристики мочевинного сенсора на основе бобовой  муки лучше, чем у сенсора на основе выделенного фермента. Более того найдено, что как катализатор  бобовая мука проявляет ярко выраженную селективность по отношению к  мочевине в присутствии разнообразных  веществ, которые потенциально могли  бы мешать определению. Преимуществами бобовой муки по сравнению с ферментом  являются также низкая стоимость  и более удобные условия хранения. Очищенная уреаза относительно дорога и должна храниться при температуре замерзания или более низкой, тогда как бобовая мука существенно дешевле и неплохо сохраняется при комнатной температуре. Таким образом, при конструировании биосенсоров мочевины мука из бобов канавалии мечевидной является хорошей заменой очищенной уреазы.

Цистейповый биосенсор

 
Для конструирования биосенсоров можно эффективно использовать и другие виды растительных материалов. Например, для определения цистеина на поверхности аммонийного датчика иммобилизуют модифицированные листья огурца. Вообще листья растений, по-видимому, имеют много преимуществ как биокатализаторы благодаря своему строению. Многие листья имеют многослойную структуру, включающую восковое покрытие (кутикулу) с внешней стороны листа, слой эпидермальных клеток (эпидермис) и примыкающий к нему губчатый промежуточный слой; те же слои повторяются в обратном порядке на другой стороне листа. Кутикула обладает гидрофобными свойствами, однако проницаема для газов. Газообмен осуществляется через небольшие отверстия на поверхности листа, называемые устьицами. Губчатый промежуточный слой наиболее активен в метаболических процессах с участием газов. Для получения биокаталитических мембранных электродов срезают кутикулу с наружной или нижней стороны листа и помещают оставшуюся часть листа на газочувствительный потенциометрический электрод так, чтобы открытый эпидермальный слой находился в контакте с анализируемым раствором, а газопроницаемая восковая кутикула-с внутренними элементами сенсора.
Этот принцип был продемонстрирован, в частности, при разработке L-цистеиново-го биосенсора с использованием огуречных листьев и аммиачного датчика [45]. В листьях огурца содержится фермент L-цистеиндесульфгидролаза, катализирующий реакцию
 

 
Таким образом, в цистеиновых сенсорах можно использовать электроды, чувствительные либо к NH3, либо к H2S, хотя из химических соображений первые предпочтительнее.
Методика изготовления цистеинового биосенсора довольно проста. Огурцы (Cucumis saturis) выращивают из семени в почве для рассады. По мере необходимости отрываю! зрелые листья и вымачивают их в воде в течение 45 мин. При вымачивании кутикула размягчается и легко удаляется, обнажая биохимически активный эпидермис. Эта процедура необходима, так как субстрат, L-цистеин, с трудом диффундирует через восковый слой кутикулы. Затем из листа вырезают диск нужного размера, помещают его на торец газового датчика и закрепляют диализной мембраной.
В фосфатном буферном растворе с  рН 7,6 электродная функция такого биосенсора характеризуется наклоном около 35 мВ/рС в диапазоне от 10"3 до 10"5 М. Такой относительно низкий наклон градуировочной кривой, наряду с довольно большим временем отклика, свидетельствует о необходимости дальнейшего совершенствования этого биосенсора. Однако благодаря большому сроку службы сенсоров (до четырех недель) и исключительно низкой стоимости листья и их фрагменты как биокатализаторы вполне могли бы конкурировать с иммобилизованными ферментами и клетками.

 Митохондриальные биосенсоры


и т.д.................


Перейти к полному тексту работы


Скачать работу с онлайн повышением уникальности до 90% по antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru


Смотреть полный текст работы бесплатно


Смотреть похожие работы


* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.