Здесь можно найти образцы любых учебных материалов, т.е. получить помощь в написании уникальных курсовых работ, дипломов, лабораторных работ, контрольных работ и рефератов. Так же вы мажете самостоятельно повысить уникальность своей работы для прохождения проверки на плагиат всего за несколько минут.

ЛИЧНЫЙ КАБИНЕТ 

 

Здравствуйте гость!

 

Логин:

Пароль:

 

Запомнить

 

 

Забыли пароль? Регистрация

Повышение уникальности

Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp», которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение уникальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения уникальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии и при повышении уникальности не вставляет в текст скрытых символов, и даже если препод скопирует текст в блокнот – не увидит ни каких отличий от текста в Word файле.

Результат поиска


Наименование:


Диплом Биохимические основы патогенеза атеросклероза. Перекисное окисление липицидов. Антиоксиданты в жировом организме. Изучение антиоксидантных свойств селенопирана. Определение концентрации общего холестерина. Результаты исследований.

Информация:

Тип работы: Диплом. Предмет: Биология. Добавлен: 15.12.2008. Сдан: 2008. Уникальность по antiplagiat.ru: --.

Описание (план):


36
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
Пензенский государственный педагогический университет
имени В.Г. Белинского
Факультет Кафедра
Естественно-географический Биохимии
ДИПЛОМНАЯ РАБОТА НА ТЕМУ:
Антиатеросклеротическое действие смеси масел льна и расторопши с селенопираном




Студент________________________________________Краснова Ю.В.
Руководитель___________________________________Петрушова О. П.
________________Кравченко Ю. В.
К защите допустить. Протокол № от «_____» ____________2007 г.
Зав. Кафедрой______________________________________Генгин М. Т.
Пенза, 2007 год
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АО - антиоксиданты
АКМ - активные кислородные метаболиты
АС - атеросклероз
БОТ - бутилокситолуол
ВЖР - высокожировой рацион
ГМК - гладкомышечные клетки
ДК - диеновые коньюгаты
ИА - индекс атерогенности
ЛНП - липопротеиды низкой плотности
ЛОНП - липопротеиды очень низкой плотности
ЛП - липопротеиды
ЛВП - липопротеиды высокой плотности
мГМК - модифицированные ГМК
МДА - малоновый диальдегид
мЛНП - модифицированные ЛНП
ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты
ПОЛ - перекисное окисление липидов
СМЛР - смеси масел льна и расторопши с селенопираном
СП - селенопиран
ТГ - триглицеридов
ТФ - токоферол
ХС - холестерин
ХС- ЛВП - холестерин липопротеидов высокой плотности
ХС- ЛНП - холестерин липопротеидов низкой плотности
ХС- ЛОНП - холестерин липопротеидов очень низкой плотности
ХСобщ - общий холестерин
ЭХС - эфиры холестерина

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в диетотерапии и профилактике различных заболеваний, особенно сердечно-сосудистой системы, широко используются полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) семейства Омега-3. В многочисленных клинических и экспериментальных исследованиях выявлен положительный эффект применения данных жирных кислот, связанный с их влиянием на липидный обмен, иммунологическую реактивность и механизмы свертывания крови. Большинство подобных исследований [26, 27, 31] посвящено изучению эффективности ПНЖК, входящих в состав рыбных жиров. Растительным жирам в этом смысле уделено гораздо меньше внимания, хотя традиционным в России сырьем для получения масла, богатого альфа-линоленовой кислотой (семейства Омега-3), является семя льна. Комбинируя масло семян льна с другими растительными маслами, можно добиться оптимального соотношения ПНЖК класса Омега-3 и Омега-6, рекомендованного для целей диетотерапии. Существенным недостатком пищевого масла, богатого ПНЖК, является низкий срок хранения из-за высокой способности этих жирных кислот к окислению, поэтому актуальным является поиск способа стабилизации продукта. Второй аспект проблемы заключается в биологической целесообразности употребления такого масла. Известно, что в условиях недостатка в организме антиоксидантов поступление в него ПНЖК может приводить к индукции перекисного окисления липидов [36]. Решением этих вопросов может служить введение в композицию масла расторопши пятнистой с комплексом флаволигнанов [10] и синтетического антиоксиданта (АО). В качестве жирорастворимого АО в данной работе исследовалось органическое соединение селена - 9-фенил-симметричный октагидроселеноксантен (селенопиран - СП). Обладая высокой водородо- и электронодонорной активностью, данное соединение препятствует образованию перекисей [3]. Кроме того, СП в живом организме подвергается метаболизации в системе микросомального окисления [4], после чего из него высвобождается атом селена, встраивающийся в селенопротеины, основной функцией которых является антиоксидантная защита.

Целью нашей работы было исследование антиоксидантных свойств селенопирана in vitro, а также изучение антиатеросклеротического действия смеси масел льна и расторопши, стабилизированной селенопираном при моделировании экспериментального атеросклероза.
При выполнении работы были поставлены следующие задачи:
Исследовать количество липидов плазмы крови и их соотношение.
1. Изучить влияние смеси масел льна и расторопши, стабилизированной селенопираном, на процессы перекисного окисления липидов.
2. Выявить влияние смеси масел льна и расторопши, стабилизированной селенопираном, на процесс атерогенеза.
Научная новизна. Впервые выявлено антиатеросклеротическое действие смеси масел льна и расторопши, стабилизированной селенопираном in vivo при моделировании экспериментального атеросклероза. Выявлены различия действия исследуемого масла в клетках (эритроцитах, печени) и плазме крови.
Апробация работы. Материалы работы доложены на Научной студенческой конференции ПГПУ им. В.Г. Белинского.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Атеросклероз (АС) - патологическое изменение внутреннего слоя (интимы) и мышечного слоя (медии) артерии. Слово образовано от греч. «атере» - кашица, основной компонент которой - эфиры холестерина (ЭХС), включенные в уплотненную склерозированную бляшку [2]. Клиническими проявлениями АС являются различные широко распространенные сосудистые заболевания разных органов: сердца, аорты, головного мозга, почек, нижних конечностей. Атеросклеротическая бляшка затрудняет кровоток и вызывает ишемию и гипоксию органа, а при полной закупорке сосуда бляшкой или индуцированным ею тромбом возникают грозные осложнения АС: инфаркт миокарда, инсульт, гангрена конечностей [2].

1.1.Биохимические ОСНОВЫ ПАТОГЕНЕЗА АТЕРОСКЛЕРОЗА

По мере накопления экспериментальных данных по атеросклерозу, возникли разные гипотезы об этиологии заболевания и патогенезе. Все гипотезы связаны с транспортом липопротеидов (ЛП) и холестерина (ХС) в сосудистую стенку. Повышенный уровень ХС является, бесспорно, главным патогенетическим фактором развития атеросклероза, существенную роль играют и другие факторы риска: факторы повреждения эндотелия (инфекции, воспаления, гипертония, токсические факторы, например никотин, высокие содержания липопротеинов низкой плотности (ЛНП) и липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП), повышенная свертываемость крови, гемодинамические факторы (бляшки возникают в местах изгибов, ветвления, стенозов сосудов) и изменение содержания гормонов, но, пожалуй, важнейшим фактором можно назвать химическую и физико-химическую модификацию ЛНП (гликозилирование, перикисное окисление ХС и ПНЖК в ЛНП, десиалирование, частичный протеолиз, агрегация) [2].

В состав атеросклеротических бляшек входят: ЭХС, триацилглицерины, гликозаминогликаны, коллаген, эластин, кальций, макрофаги, модифицированные гладкомышечные клетки (мГМК), погибшие клетки. В атеросклеротических бляшках с большой частотой обнаруживаются ДНК герпесвирусов (цитомегаловируса и простого герпеса), а также хламидии. Роль этих микроорганизмов остается пока невыясненной. При разрыве фиброзной капсулы под действием механических и токсических факторов обнажается холестериновая кашица, и такая злокачественная бляшка становится центром агрегации тромбоцитов, отложения сгустков фибрина и тромбообразования [2].

Учитывая все перечисленные этиологические и патогенетические факторы, можно привести пример механизма интегральной модели АС артериальной стенки. В норме ЛНП крови транспортируют в эндотелий и другие клетки сосуда ХС, необходимый им для формирования мембран. При гиперхолестеринемии, обусловленной повышенным уровнем ЛНП, или при модификации ЛНП, главный поток ХС, во внутреннюю стенку сосудов, осуществляют моноциты. Последние фагоцитируют ЛНП, модифицированные ЛНП (мЛНП), аутоиммунные комплексы мЛНП с антителами и переносят ХС в субэндотелиальный участок интимы. ЛНП разрушаются в эндолизосоме, освобождая ХС, который накапливается в цитозоле макрофагов в виде капель ЭХС, придавая клеткам пенистый вид («пенистые» клетки). Этерификацию ХС катализирует ацетил-коэнзим А-холестеринацилтрансфераза, активируемая свободным ХС. «Пенистые» клетки, погибая освобождают ХС в межклеточное пространство для формирования бляшек [2].

Источником ХС бляшек так же служат гладкомышечные клетки (ГМК). Активированные макрофаги продуцируют в интиме цитокины (интерлейкин - 1 и др.), которые стимулируют миграцию ГМК из медии сосуда в интиму, а так же их пролиферацию и трансформацию в ГМК синтезирующего типа («миома сосуда»). Последние продуцируют коллаген и другие структуры соединительной ткани фиброзной бляшки. мГМК также фагоцитируют ЛНП и мЛНП, превращаясь в «пенистые » клетки [2].

Около 70% ХС крови содержится в составе ЛНП. Уровень ХС в крови зависит от огромного количества факторов: поглощаемой пищи, синтеза и регуляции, транспорта, расходования на синтез жирных кислот и других соединений с выведением. При патологических процессах нарушается динамическое равновесие между указанными факторами, что может привести к гиперхолестеринемии. Следовательно, гиперхолестеринемия - главный фактор риска развития атеросклероза, как правило, связана с увеличением содержания в крови ЛНП и их предшественников ЛОНП - двух атерогенных ЛП. Поэтому более строгим фактором риска следует считать не гиперхолестеринемию, а дислипопротеинемию - количественное преобладание ЛНП, ЛОНП и качественные изменения в структуре ЛНП (мЛНП) [2]. В формировании модифицированных липопротеидов центральную роль играют процессы свободнорадикального окисления (перекисное окисление липидов (ПОЛ)).

1.2. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ

Из всех классов ЛП ПОЛ затрагивает в первую очередь именно ЛНП [14]. ПОЛ в частицах ЛНП - сложный многоступенчатый и еще не до конца выясненный процесс. Постоянно возникающие в животном организме свободные радикалы О-2, HO*2 и НО- гене-рируют образование гидроперекисей ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов, триглицеридов (ТГ) и ЭХС ЛНП [14].

ПОЛ - цепная свободнорадикальная реакция. На первых стадиях 92-98 % всех продуктов окисления составляют гидроперекиси, образованию которых предшествует гидроперекисный радикал ROO* (образуется в акте одноэлектронного окисления с появлением сопряженных двойных связей) [Камышников В.С., 2000]. Преобразование липидов в гидроперекиси жирных кислот (ацилгидроперекиси - первичные продукты ПОЛ) приводит к образованию «пор» в мембранах, через которые наружу выходит содержимое клетки и органелл. Первичные продукты ПОЛ неустойчивы и разрушаются. Вторичные продукты ПОЛ: альдегиды, кетоны, спирты и эпоксиды. Продукты ПОЛ способствуют агрегации тромбоцитов, уменьшению синтеза простагландинов, антикоагулянтному действию и разрушению мембран [12].

Трудно точно назвать место, где образуются перекисно-модифицированные ЛНП. По-видимому, значительная часть их образуется в крови в результате окисления липидов в этих комплексах при участии клеток белой крови, генерирующих активные кислородные радикалы. Поскольку гранулоцитарные лейкоциты не проникают в интиму артерий, есть основания полагать, что их участие в окислении ЛНП происходит не в артериальной стенке, а именно в кровотоке. Другая потенциальная возможность перекисной модификации частиц возникает в процессе циркуляции в кровяном русле в результате контакта ЛП с клетками эндотелия. Аналогичной способностью модифицировать ЛНП обладают и другие клетки: ГМК, активированные моноциты и лейкоциты и даже фибробласты. Речь идет, следовательно, о перекисной модификации ЛП, индуцированной клетками [14]. .В образовании мЛНП участвуют так же ферменты, объединенные общим названием липоксигеназы. Нельзя исключить и то, что процесс пероксидации ЛНП может продолжаться и в самой интиме вследствие контакта с другими клетками (макрофагами и др.) и недостатка в интиме АО [14].

Таким образом, множество данных указывает на то, что реакции свободнорадикального окисления липидов являются необходимым атрибутом процесса атерогенеза.

1.3. АТЕРОГЕНЕЗ

Многие исследователи отмечают, что необходимым условием атерогенеза является повреждение стенки сосуда, что приводит к секвестрации и накоплению в интиме фагоцитирующих клеток с последующим их перерождением в «пенистые» клетки. Тот факт, что формирование «пенистых» клеток происходит при инкубации макрофагов только с окисленными или модифицированными («атерогенные ЛНП»), но не с нативными ЛНП, послужил основой концепции, согласно которой, начальным этапом атерогенеза является возникновение окисленных ЛНП, цитотоксичных для эндотелиоцитов и усиливающих адгезию нейтрофилов, что вызывает повреждение эндотелия; захват окисленных ЛНП макрофагами и приводит к образованию «пенистых» клеток, их накоплению в интиме сосудов и в последующем - к формированию атеросклеротической бляшки [20, 33, 37, 38]. Таким образом, свободнорадикальные реакции с участием активированных кислородных метаболитов (АКМ) являются атерогенным фактором, так как вызывают модификацию ЛП (преимущественно ЛНП) плазмы крови; кроме того АКМ и продукты их реакции, в том числе и окисленные ЛП, оказывают цитотоксическое и деструктивное воздействие на клетки и ткани [23, 29], что может лежать в основе повреждения сосудов [16]. Множество экспериментальных, клинических и эпидемиологических исследований позволяют отнести АС к классическим свободно радикальным патологиям [1, 6].

В моноцитах (макрофагах) и в эндотелии сосудов основную роль в поглощении окисленных ЛНП играют не ЛНП-рецепторы, а особые нерегулируемые скэвенджер-рецепторы, (рецепторы - «мусорщики») для модифицированных ЛНП [21]. Общим признаком всех лигандов для скэвенджер - рецепторов является наличие полианионных комплексов («рецептор-липучка»). Скэвенджер - рецепторы связывают только модифицированные ЛНП, и их экспрессия не регулируется внутриклеточным содержанием холестерина [21]. Больше всего скэвенджер - рецепторов выявляется в моноцитах/ макрофагах [34].

Проникновению моноцитов в эндотелиальную стенку предшествует их адгезия на поверхности эндотелия, по-видимому, в ответ на появление в интиме мЛНП и секрецию хемотаксических веществ - хемоатрактантов. Адгезивные молекулы обеспечивают прилипание моноцитов на поверхности эндотелия. Часть проникших в интиму моноцитов/макрофагов подвергается в ней пролиферации [35].

Значительная часть макрофагов после захвата ими мЛНП и накопления в них ЭХС трансформируется в «пенистые» клетки и остается в интиме. Подавляющая часть «пенистых» клеток гибнет, при этом в интиму изливаются накопленные в них ЭХС, ненасыщенных эфиров холестерина и кристаллы моногидрата ХС. Образуются очаговые скопления ХС и создается угроза развития сначала липидных пятен, а затем и атеросклеротических бляшек [13].

Оценивая участие макрофагов в атерогенезе, следует сказать, что эти клетки, захватывая мЛНП, стремятся выжить и покинуть артериальную стенку вместе с захваченными ЛП. Об этом свидете6льствует активация пролиферации макрофагов в интиме при появлении в ней мЛНП и миграция макрофагов из интимы в кровяное русло еще до превращения в «пенистые» клетки. Есть и другие пути избавления стенки сосуда от ХС [13]:

- гидроксилирование ХС и превращение его в более растворимые производные, которые клетка секретирует в окружающую среду.

- усиленный синтез макрофагами аполипопротеина Е и фосфолипидов с последующим образованием дискоидальных комплексов, способных связывать и удалять ХС из клетки.

- гидролиз ЭХС и удаление ненасыщенных эфиров холестерина при участии ЛВП.

- уменьшить содержание ХС и ЛНП в крови могут такие гормоны, как иодтиронины и эстрогены. Иодтиронины индуцируют на уровне транскрибции образование ЛНП-рецепторов и 7-гидроксилазы печени - регуляторного фермента синтеза желчных кислот из ХС. Эстрогены ингибируют образование последнего фермента, но активируют синтез ЛНП-рецепторов и ГМГ-СоА-редуктазы печени (регуляторный фермент синтеза ХС) [2].

Одним из важных защитных механизмов можно считать действие различных АО, которые являются ингибиторами образования мЛНП.

1.4. АНТИОКСИДАНТЫ В ЖИВОМ ОРГАНИЗМЕ

В живом организме функционирует внутренняя система антиоксидантной защиты, представленная ферментами (глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионредуктаза) и низкомолекулярными соединениями (тиоловые соединения, мочевая кислота, некоторые пептиды). Помимо этого, многие низкомолекулярные соединения, образующиеся в организме или поступающие с пищей (водорастворимые или жирорастворимые), способны служить в качестве компонентов антиоксидантной защиты клеток, внутри- и межклеточной жидкости (аскорбиновая кислота, мочевая кислота, токоферол, флавоноиды, каротиноиды, и др.). Неферментные АО- низкомолекулярные соединения, перехватчики радикалов и активных кислородных метаболитов. Общим признаком очень многих АО является их способность выступать в качестве донора протона функциональной группы. По строению функциональной группы важнейшие для человека и млекопитающих низкомолекулярные АО можно разделить на соединения, содержащие SH-группы (тиоловые АО) и ОН- группы (фенольные АО) [15].
Тиоловые соединения
В свете современных данных становится все более очевидной ведущая роль тиоловых соединений в механизме антиоксидантной защиты. К такому заключению приводят несколько обстоятельств [19]. К примеру, основная часть функциональных компонентов антиоксидантной системы представлена веществами тиоловой природы. Так, в состав неферментного звена входят низкомолекулярные тиолы (глутатион, тиоредоксин и др.) и тиол содержащие белки, которые по некоторым данным [32] даже более реактивны по отношению к АКМ, чем глутатион. К тиоловым компонентам сыворотки крови млекопитающих относятся альбумины, представляющие собой важные внеклеточные АО [28]. Ферменты, принимающие участие в противоокислительной защите, либо относятся к собственному числу тиоловых энзимов, либо нуждаются в присутствии тиолов для проявления каталитической активности. Во-вторых, уникальные химические свойства тиолов наделяют их высокой антиокислительной способностью [15].
Фенольные соединения, имеющие в своей структуре ароматическое кольцо с несколькими ОН-группами, также являются мощными перехватчиками радикалов, эффективность которых возрастает в зависимости от количества гидроксильных заместителей цикле [15].
Важную роль в защите клеток, и главным образом, их мембран от окислительных повреждений играют токоферолы (ТФ), антиокислительное действие которых реализуется двумя путями. Во-первых, ТФ способны стабилизировать мембраны за счет хорошей растворимости в фосфолипидах и взаимодействия их с жирнокислыми цепями, что увеличивает плотность упаковки фосфолипидов в мембране и снижает вероятность их окисления. Вторым проявлением антиоксидантных свойств токоферолов является их способность перехватывать АКМ и ингибировать ПОЛ, в результате чего образуются малоактивные токоферильные радикалы, которые легко восстанавливаются аскорбиновой кислотой, убихиноном или мочевой кислотой, что обеспечивает регенерацию витамина Е [11, 22].
Одним из наиболее важных водорастворимых низкомолекулярных АО считают аскорбиновую кислоту, действие которой распространяется на широкий спектр АКМ. Способность аскорбиновой кислоты восстанавливать токоферил-радикалы обеспечивает синергическое действие системы аскорбат-токоферол в гетерогенных средах, содержащих водную и липидную фазы [24].однако в присутствии ионов металлов переменой валентности аскорбиновая кислота способна восстанавливать их, и, таким образом проявлять прооксидантное действие [8].
Мочевая кислота, помимо способности хелатировать ионы железа и меди, обладает прямым антиоксидантным действием за счет способности ингибировать оксиды азота, супероксид-анион радикал, гидроксильный радикал и синглетный кислород, а также гемовые оксиданты. Реакция мочевой кислоты с гидроксильным радикалом при физиологических рН в большинстве случаев приводит к конформационной перестройке молекулы с образованием аллантоина, в свою очередь способного окисляться гидроксильным радикалом до парабановой кислоты [11]. Ввиду высокого содержания мочевой кислоты в плазме крови (0,12-0,48 мМ), некоторые исследователи считают, что на ее долю приходится 35-65% защиты ЛП от окисления, 10-15% ингибирования гидроксильного радикала и 12% ингибирования синглетного кислорода.
В плазме крови имеется большое количество других соединений, способных взаимодействовать с АКМ и тормозящих развитие свободнорадикальных реакций посредством хелатирования ионов переменой валентности. К ним относятся железосвязывающие белки: ферритин, гемосидерин и трансферрины; медьсвязывающий фермент церулоплазмин; молочная и мочевая кислот; некоторые пептиды, гормоны и гормоноподобные вещества [11].
Таким образом, учитывая ведущую роль в патогенезе атеросклеротических повреждений процессов окислительной модификации ЛП, весьма интересным представляется изучение влияния пищевых АО (особенно жирорастворимых) в условиях гиперхолестеринемии, сопровождающейся окислительным стрессом, на атерогенез. Не менее важным представляется проанализировать комплексное воздействие эссенциальных жирных кислот класса Омега-6, Омега-3 и АО, так как известно, что ПНЖК являются быстроокисляемым субстратом (т.е. могут провоцировать развитие антиоксидантной системы), с одной стороны, и незаменимыми регуляторами состояния эндотелия, тонуса сосудов и процессов свертывания крови (т.е. могут препятствовать развитию антиоксидантной системы), с другой стороны.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ И УСЛОВИЯ ОПЫТОВ

Изучение антиатеросклеротического действия СМЛР выполнено в эксперименте на животных в общепринятой модели. Эксперимент проведен на 30 половозрелых белых крысах-самцах Вистар весом 270-410 г. В зависимости от условий эксперимента животные были разделены на 3 равные по численности группы: контрольную и две опытные.

Таблица 1

Состав экспериментальных рационов

Наименование
Рацион (количество в г.)
1
2
3
4
Казеин
197
197
197
197
Метионин
3
3
3
3
Крахмал
445
445
280
280
Сахар
175
175
175
175
Отруби
50
50
50
50
Масло подс. контр.*
45
35
10
-
Холина хлорид
5
5
5
5
Солевая смесь**
70
70
70
70
Витаминная смесь***
10
10
10
10
Холестерин
-
-
10
10
СМЛР****
-
10
-
10
Масло окисленное*****
-
-
190
190
* масло в 45 г содержит: ретинола ацетата 15000 МЕ, эргокальциферола - 500 МЕ
** состав солевой смеси представлен в таблице 2
*** в 1 г содержит: тиамина (В1) - 0,6 мг, рибофлавина (В2) - 0,6 мг, пиридоксина (В6) - 1,5 мг, никотиновой кислоты - 3,0 мг, пантотената кальция - 1,6 мг, фолиевой кислоты - 1,0 мг, цианкобаламина (В12) - 0,003 мг, викасола - 0,1 мг, Д-биотина - 0,02 мг, токоферола ацетата - 15 мг, глюкозы - до 1 г.
**** - СМЛР содержит (г/100 г): нерафинированное масло льна - 14,3 , нерафинированное масло расторопши - 85,7, селена - 0,001 в составе селенопирана, жирнокислотный состав см. в таблице 3
***** - масло окисленное в 200 г содержит: ретинола ацетата 15000 МЕ, эргокальциферола - 1500 МЕ
Таблица 2
Состав солевой смеси

Название соли
Химическая формула
Количество, г
1
Хлористый натрий
NaCl
139,3
2
Калий фосфорнокислый, однозамещенный
KH2PO4
388,8
3
Магний сернокислый
MgSO4
57,4
4
Кальций углекислый
CaCO3
380,4
5
Железо сернокислое
FeSO4*7H2O
26,4
6
Калий йодистый
KI
0,77
7
Марганец сернокислый
MnSO4*7H20
4,55
8
Цинк сернокислый
ZnSO4*7H2O
0,53
9
Медь сернокислая
CuSO4*5H2O
0,48
10
Кобальт хлористый
CoCl2*6H2O
0,024
11
Натрий фтористый
NaF
0,50
12
Алюмокалиевые квасцы
K2SO4Al2(SO4)3*24H2O
0,11
ИТОГО
1000
На первом этапе эксперимента (14 дней) животные контрольной группы и первой опытной группы получали рацион, содержащий (по калорийности) 20% белка (казеин), 70% углеводов, 10% жиров (подсолнечное масло) (таблица 1, рацион 1). Животные второй опытной группы получали рацион с замещением части жира СМЛР (таблица 1, рацион 2). Витамины и минеральные вещества добавляли в соответствии с физиологическими нормами (таблица 1 и таблица 2). Корм животным давали вволю, доступ к воде был свободным.
На втором этапе эксперимента (28 дней) животные контрольной группы получали рацион 1, животные опытных групп получали высокожировой рацион (ВЖР), содержащий 10 г/кг холестерина и 40% жиров по калорийности (подсолнечное масло, перекисное число которого составляло 38 ммоль активного кислорода на 1 кг продукта). В первой опытной группе 5% жира замещали обычным (неокисленным) подсолнечным маслом (таблица 1, рацион 3), во второй опытной группе - СМЛР (таблица 1, рацион 4).
Таблица 3
Жирнокислотный состав смеси масел льна и расторопши (СМЛР)
Наименование
Количество, %
Сумма насыщенных жирных кислот
13,71
Сумма мононенасыщенных жирных кислот
27,39
Сумма ПНЖК, из них:
58,99
Линолевая (-6) С18:2
50,1
-линоленовая (-6) С18:3
0,03
-линоленовая (-3) С18:3
8,86
Соотношение -6/-3
5,66

2.2. ПОДГОТОВКА БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ БИОХИМИЧЕСКОГО И ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

После окончания эксперимента животных выдерживали 12 часов без корма, затем наркотизировали тиопенталом натрия в дозе 6 мг на 100 г веса. После чего вскрывали брюшную полость, пунктировали брюшную аорту и собирали кровь в пробирки с гепарином, центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Готовые гемолизаты эритроцитов (разведение 1:1) и плазму затем замораживали и хранили при - 18°С- - 20°С до исследования. Затем перфузировали печень in situ через соустье полой вены охлажденным физиологическим раствором. Далее извлекали печень, промывали охлажденным физраствором, продавливали через металлический пресс с диаметром отверстий 0,2 мм и готовили гомогенаты. Печень гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейма с тефлоновым пестиком (зазор 0,18-0,2 мм) в течение 90 с при 1200 об/мин. Гомогенат хранили при -18°С- - 20°С.

Для гистологического исследования брали грудной и брюшной отдел аорты. Аорту фиксировали 10% формалином, вскрывали по длине, проводили макроскопическое исследование, далее готовили срезы методом парафиновой проводки, окрашивали гематоксилином + эозином, проводили микроскопическое исследование

2.3. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.3.1. Изучение антиоксидантных свойств селенопирана in vitro

Изучение антиоксидантных свойств СП in vitro проводили в системе нерафинированных растительных масел: подсолнечного, смеси масел льна и расторопши пятнистой. В модельной системе с подсолнечным маслом для сравнения использовали бутилокситолуол (БОТ) и ТФ. При этом концентрация АО (в том числе и СП) составляла 0,01% от массы. Контролем служило чистое масло. Окисление проводили при температуре 80 С, пропуская через масло воздух со скоростью 5 л/ч. Автоокисление смеси масел льна и расторопши (1:6, v/v) проводили в мягких условиях - при комнатной температуре без принудительного пропускания воздуха. СП или ТФ добавляли в смесь масел в концентрации 0,005%. Контролем служила смесь масел без АО. Количество пероксидов определяли йодметрическим титрованием [ГОСТ 26593-85].

2.3.2. Определение перекисного числа йодометрическим титрованием по ГОСТ 26593-85

Метод основан на окислении йодистого калия перекисями и гидроперекисями, содержащимися в образце, в растворе уксусной кислоты и хлороформа и титровании выделившегося йода раствором тиосульфата натрия.

Пробу отвешивают в колбу или пробирку, помещают навеску в колбу. Добавляют 10 см3 хлороформа, растворяют навеску, приливают 15 см3 уксусной кислоты и 1 см3 раствора йодистого калия, колбу сразу же закрывают, перемешивают содержимое в течение 1 мин и оставляют на 5 мин в темном месте при температуре 15-25°С. Затем добавляют 75 см3 воды, тщательно перемешивают и добавляют пять капель раствора крахмала. Выделившийся йод титруют раствором тиосульфата натрия, используя раствор следующей концентрации в зависимости от предполагаемого значения перекисного числа. С (?Na2S2O3) = 0,002 моль\дм3 , если перекисное число не более 6,0 моль\кг или с (?Na2S2O3) = 0,01 моль\дм3, если перекисное число равно или более 6,0 моль\кг [Издательство стандартов, 1994]. Массу пробы, необходимой для измерений, в зависимости от предполагаемого перекисного числа определяют по таблице:

Предполагаемое значение перекисного числа, моль\кг
Масса испытуемой пробы, г
От 0 до 6,0
5,000-2,000
От 6,0 до 10
2,000-1,200
От 10,0 до 15,0
1,200-0,600
От 15,0 до 25,0
0,600-0,500
От 25,0 до 40,0
0,500-0,300

Для каждой испытуемой пробы выполняется два измерения. Контрольные измерения проводят параллельно с основными измерениями. Если на контрольное измерение пойдет более 0,1 см3 (0,01 моль\дм3) раствора тиосульфата натрия, то проверяют соответствие реактивов стандарту.

Вычисление результатов измерения: Перекисное число Х в миллимолях активного кислорода на килограмм пробы вычисляют по формуле

Х = (V1-V0)*c*1000 \ m

V0 -объем раствора тиосульфата натрия, использованный при контрольном измерении, см3

V1 - объем раствора тиосульфата натрия, использованный при измерении, см3

C - концентрация использованного раствора тиосульфата натрия моль\дм3

1000 - коэффициент учитывающий пересчет результата измерения в ммоль\кг

m - масса испытуемой пробы, г

За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных измерений.

2.3.3. Определение концентрации общего холестерина (ХСобщ) в сыворотке и плазме крови энзиматическим колориметрическим методом

ПРИНЦИП МЕТОДА. При гидролизе ЭХС холестеразой образуется свободный ХС. Образуется и имеющийся в пробе ХС: окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Под действием (РОД) перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации в пробе.

Набор реагентов: CHOLESTEROL «E - D» («Vital-Diagnostics»)

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

Реагенты

Опытные

пробы,(мл.)
Калибровочные пробы, (мл.)
Контрольные пробы, (мл.)
Сыворотка или плазма
0,02
_
_
Физ. Раствор (H2O)
_
_
0,02
Реагент 2
2,0
2,0
2,0
Раствор холестерина
_
0,02
_

Реакционную смесь перемешивают и инкубируют не менее 5 мин при комнатной температуре (20-25°С) или при 37°С и измеряют оптическую плотность опытных и калибровочных проб против контрольной пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 см (1 см.) при длине волны 500 нм (ФЭК- 490 нм). Окраска стабильна не менее 2-х часов после окончания инкубации при предо и т.д.................


Перейти к полному тексту работы



Смотреть похожие работы


* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.