На бирже курсовых и дипломных проектов можно найти образцы готовых работ или получить помощь в написании уникальных курсовых работ, дипломов, лабораторных работ, контрольных работ, диссертаций, рефератов. Так же вы мажете самостоятельно повысить уникальность своей работы для прохождения проверки на плагиат всего за несколько минут.

ЛИЧНЫЙ КАБИНЕТ 

 

Здравствуйте гость!

 

Логин:

Пароль:

 

Запомнить

 

 

Забыли пароль? Регистрация

Повышение уникальности

Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp», которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение уникальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения уникальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии и при повышении уникальности не вставляет в текст скрытых символов, и даже если препод скопирует текст в блокнот – не увидит ни каких отличий от текста в Word файле.

Результат поиска


Наименование:


диссертация Биологическая роль нейропептидов и их обмен. Функционирование пептидэргических систем на разных стадиях эстрального цикла. Уровень нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла. Ферменты обмена нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла.

Информация:

Тип работы: диссертация. Предмет: Биология. Добавлен: 27.03.2007. Сдан: 2007. Уникальность по antiplagiat.ru: --.

Описание (план):


1
2

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В. Г. БЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

Сметанин Владимир Анатольевич

ВЛИЯНИЕ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ НА АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ САМОК КРЫС НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЭСТРАЛЬНОГО ЦИКЛА


03.00.04 - Биохимия
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель доктор биологических наук профессор Генгин М.Т.

ПЕНЗА 2004
СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………............5

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………..6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………..........10

1.1. Биологическая роль нейропептидов и их обмен………………………….10

1.2. Функционирование пептидэргических систем на разных стадиях эстрального цикла………………………………………………………………..12

1.2.1. Уровень нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла…………………………………………………………………………......12

1.2.2. Ферменты обмена нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла……………………………………………………………………………...17

1.3. Этанол и его влияние на пептидэргические системы…………………….21

1.3.1. Влияние этанола на уровень нейропептидов в организме…..................21

1.3.2. Влияние этанола на активность ферментов обмена нейропептидов…………………………………………………………..29

1.4. Карбоксипептидаза Н………………………………………………...........32

1.5. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза…………………………..……35

1.6. Карбоксипептидаза М…………………………………………….…...........37

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………..…39

2.1. Материалы исследования…………………………………………..............39

Методы исследования……………………………………………………………......40

2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М……………………………………………………............40

2.2.2. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы…………………………………………………………..…..41

2.2.3. Статистическая обработка результатов исследования………………….…42

2.3. Схема эксперимента………………………………………………………....43

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………........44

3.1. ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ САМОК КРЫС НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЭСТРАЛЬНОГО ЦИКЛА………………………………………….44

3.1.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла……………………………………............44

а) Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных самок крыс…………………………………………………………………..……44

б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок …………………………………..45

в) Исследование активности карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс………………………………………...48

3.1.2. Изучение активности ФМСФ-КП в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла……………………………………………………..59

а) Распределение активности ФМСФ-КП в тканях интактных самок крыс………………………………………………………………………………59

б) Активность ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок ………………………………….60

в) Исследование активности ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс……………………………………………………62

3.1.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла……………………………………………….……74

а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самок крыс………………………………………………………………………………74

б) Активность карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок …………….…………………..75

в) Исследование активности карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс……………………………………….76

3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ САМЦОВ КРЫС …………………….81

3.2.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самцов крыс81

а) Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных самцов крыс………………………………………………………………………81

б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов………………………………….82

в) Исследование активности карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс……………………………………….84

3.2.2. Изучение активности ФМСФ-КП в тканях самцов крыс……………..91

а) Распределение активности ФМСФ-КП в тканях интактных самцов крыс……………………………………………………………………………….91

б) Активность ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов………………………………….92

в) Исследование активности ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс…………………………………………………..94

3.2.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях самцов крыс……………100

а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самцов крыс……………………………………………………………………………...100

б) Активность карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов…………….…………………..100

в) Исследование активности карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс……………………………………...101

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ…………..105

ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….133

ЛИТЕРАТУРА…………………………………………………………….........135

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ - адренокортикотропный гормон
АПМЯК - аминопропилмеркаптоянтарная кислота
АПФ - ангиотензинпревращающий фермент
ГГГС - гипоталамо-гипофизарно-гонадная система
ГГНГС - гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадная система
ГГНС - гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система
ГРФ - гонадотропин-рилизинг-фактор
ГПЯК - гуанидинопропилянтарная кислота
ГЭМЯК - гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота
ДСИП - дельта-сон-индуцирующий пептид
КПА - карбоксипептидаза А
КПВ - карбоксипептидаза В
КПН - карбоксипептидаза Н
КПM - карбоксипептидаза M
КПN - карбоксипептидаза N
ЛГ - лютеинизирующий гормон
ЛКПА - лизосомальная карбоксипептидаза А
ЛКПВ - лизосомальная карбоксипептидаза В
ПОМК - проопиомеланокортин
ПХМБ - п-хлормеркурийбензоат
ПХМФС - п-хлормеркурийфенилсульфонат
ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид
ФМСФ-КП - фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая
карбоксипептидаза
ФСГ - фолликулостимулирующий гормон
ЭПР - эндоплазматический ретикулум
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

ВВЕДЕНИЕ

Проблема алкоголизма, особенно женского, является крайне актуальной для человечества, как с социальной, так и с медицинской точки зрения. Клинические наблюдения указывают на то, что под действием этанола в организме женщины возникают существенные изменения в эндокринной системе, что сопровождается нарушениями половой функции [2, 81].

При алкоголизме существенно меняется уровень целого ряда нейропептидов, многие из которых играют существенную роль в этиологии и патогенезе данного заболевания [19, 61, 74, 88]. Изменение уровня биологически активных пептидов при алкогольной интоксикации во многом определяется ферментами их обмена, к которым, в частности, относятся карбоксипептидаза Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая кар-боксипептидаза и карбоксипептидаза М - основные карбоксипептидазы, катализирующие отщепление остатков аргинина и лизина с С-конца пептидов [28, 41, 144, 212].
Интерес к этим ферментам вызван тем, что они участвуют в процессинге, модуляции и инактивации биологически активных пептидов [28, 41, 144]. В связи с тем, что нейропептиды выполняют функции нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов, они участвуют в регуляции практически всех функций организма, в том числе и в регуляции функционирования полового цикла [11, 72], а также вовлекаются в развитие многих патологических состояний, среди которых для современной биологии и медицины особую значимость представляет алкоголизм [19, 74, 88]. Прогресс в изучении природы этого заболевания неотделим от понимания нейробиологических процессов, лежащих в его основе [80]. В этой связи представляется очень важным исследование активности основных карбоксипептидаз при острой алкогольной интоксикации. Чем глубже будут наши представления об энзимопатологии, о роли протеолитических ферментов в гомеостазе, тем более целенаправленным будет поиск лекарственных средств для лечения алкоголизма среди регуляторов активности ферментов.
Одним из важных аспектов проблемы алкоголизма является исследование нарушений, происходящих в организме женских особей при алкогольной интоксикации. Однако при этом необходим учет особенностей женского организма, связанных с наличием полового цикла, который сопровождается комплексом физиологических, биохимических и других изменений, происходящих во всем организме. В ходе эстрального цикла наблюдаются значительные изменения в функционировании пептидэргических систем [11], что, несомненно, связано с изменением активности ферментов участвующих в обмене биологически активных пептидов [28, 41] и в свою очередь, вероятно, определяет особенности ответной реакции женского организма на острую алкогольную интоксикацию на разных стадиях эстрального цикла [101, 164].
Кроме того, известно, что некоторые аспекты проявления острой алкогольной интоксикации определяются в значительной степени полом. Предполагают, что это связано с различиями в гормональном статусе самцов и самок [44]. Различный уровень нейропептидов, определяемый активностью ферментов их обмена, у особей разного пола приводит к появлению отличий в количестве потребляемого этанола, в скорости развития зависимости, а также появлению различий в течение алкогольной интоксикации у особей противоположного пола [5, 19, 64, 65].
Изучение активности карбоксипептидазо-В-подобных ферментов при острой алкогольной интоксикации может способствовать уточнению биологической роли этих ферментов, а также выяснению механизмов функционирования пептидэргических систем при данном патологическом состоянии.
Целью нашей работы было изучение активности основных карбоксипептидаз (карбоксипептидазы Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбоксипептидазы М) в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла при острой алкогольной интоксикации.
При выполнении работы были поставлены следующие задачи:
Изучить активность исследуемых карбоксипептидаз на разных стадиях эстрального цикла в тканях интактных самок крыс.
Исследовать активность карбоксипептидазы Н, фенилметил-сульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбокси-пептидазы М у самок крыс на разных стадиях эстрального цикла при введении этанола через различные промежутки времени.
Сравнить активность исследуемых ферментов у самцов и самок при острой алкогольной интоксикации.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние острой алкогольной интоксикации на активность карбоксипептидазы Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбоксипептидазы Н в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла. Для определения половых отличий в течении и развитии алкогольной интоксикации исследована активность этих ферментов в тканях самцов крыс. Установлена зависимость изменения активности исследуемых ферментов от стадии эстрального цикла, пола, дозы этанола и времени после его введения. Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов функционирования пептидэргических систем и проясняют роль основных карбоксипептидаз в норме, а также при алкогольной интоксикации и могут быть использованы для разработки эффективных методов профилактики и лечения алкоголизма, нарушений полового цикла и бесплодия.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях Российской Академии Естествознания (Россия, Дагомыс, октябрь 2003 г. и Египет, Хургада, февраль 2004 г.) и на итоговых научных конференциях ПГПУ (2002, 2003 гг.). По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 6 разделов: введение, обзор литературы по теме диссертации, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы. Работа изложена на 162 страницах, иллюстрирована 6 рисунками, 21 таблицей и 2 схемами. Список литературы содержит 268 наименований на русском и иностранных языках.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологическая роль нейропептидов и их обмен.

Важное место в химической передаче информации занимают нейропептиды [72]. Многие из нейропептидов выполняют функции нейромедиаторов, нейромодуляторов, гормонов, факторов роста [9, 51, 77, 139, 164].
Вероятно, именно биологически активным пептидам принадлежит важная роль в интеграции функциональных систем организма, обеспечении их слаженной работы в изменяющихся условиях окружающей среды. Они играют ключевую роль в регуляции полового цикла, деятельности иммунной системы, в морфогенезе, участвуют в формировании поведенческих реакций, в процессах обучения, механизмах консолидации памяти, влияют на половую дифференциацию [8, 11, 60, 70, 72, 210], вовлекаются в развитие и патогенез многих психических и неврологических расстройств, в том числе и алкоголизма. Так, например, у особей исходно склонных к развитию алкоголизма, выявлен центральный (тотальный или региональный) дефицит нейропептидов, функция которых связана с активацией системы положительного подкрепления (с эйфоризирующим, антистрессорным, анксиолитическим действием). Одновременно отмечается увеличение содержания нейропептидов, активирующих систему негативного подкрепления (проконвульсанты, пептиды, индуцирующие страх, агрессию, дисфорию). Как правило, однократное введение этанола, особенно в низких, анксиолитических дозах, нивелирует эти диспропорции, с чем, очевидно, и связано развитие влечения к этанолу, особенно у предрасположенных к алкоголизму индивидуумов[15, 19, 62, 80].
По современным представлениям функционирование конкретного регуляторного пептида связывается с местом его образования, высвобождения и наличия соответствующих рецепторов [52, 53, 54, 69]. Таким образом, для понимания механизмов действия нейропептидов существенным моментом является изучение их образования и деградации.
Большинство биологически активных пептидов синтезируется в составе высокомолекулярных неактивных предшественников - препробелков, которые подвергаются посттрансляционной модификации различного типа [75, 114, 181, 256]. Секретируемые белково-пептидные продукты синтезируются на мембраносвязанных рибосомах ЭПР [156, 256]. Благодаря наличию на N-конце препроформы нейропептида набора гидрофобных аминокислот, так называемой сигнальной последовательности, предшественник транслоцируется через мембрану ЭПР. Внутри ЭПР сигнальная последовательность отщепляется от полипептидной цепи сигнальной пептидазой. Далее процессинг осуществляется в ходе передвижения молекул пропептидов по гранулярному ЭПР, комплексу Гольджи и в секреторных везикулах [29, 256].
Сначала под действием эндопептидаз, расщепляющих нейропептиды по синглетным и дуплетным остаткам основных аминокислот, (фурин, РС1/3, РС2, РС4 [242], проопиомеланокортин-превращающий фермент [193, 194], тиоловая прогормонконвертаза [96, 97], динорфин-превращающий фермент [129] и др.) образуются неактивные пептиды [1, 29, 72], содержащие, как правило, “лишние” N- или, в основном, С-концевые остатки аминокислот. Удаление этих аминокислот в секреторных везикулах осуществляется соответственно аминопептидазо-В-подобным(и) [41, 156] и карбоксипептидазо-В-подобным(и) ферментами [27, 29, 41, 144, 145].
Таким образом, уровень биологически активных пептидов в организме в значительной степени определяется активностью ферментов их обмена.
Основным карбоксипептидазам как ферментам, участвующим в конечных стадиях образования и начальных стадиях деградации, принадлежит важная роль в регуляции уровня нейропептидов в организме. В связи с этим, большой интерес представляет изучение активности основных карбоксипептидаз в норме и при различных физиологических и патологических состояниях организма, сопровождающихся изменением содержания биологически активных пептидов.
1.2. Функционирование пептидэргических систем на разных стадиях эстрального цикла
1.2.1. Уровень нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла
Большой интерес представляет изучение гормонального статуса организма в разных физиологических состояниях, в том числе в ходе эстрального цикла. В регуляции полового цикла ключевую роль играют пептидные гормоны гипофиза и гипоталамуса: ГРФ, ЛГ, ФСГ, пролактин [57, 58, 57, 82, 84, 265], а также многие нейропептиды, основные функции которых не связаны с половой системой: энкефалины [182], эндорфины, АКТГ [264], вещество Р [224] и др. Установлено, что уровень многих нейропептидов изменяется в зависимости от стадии эстрального цикла [11].
Так у крыс в преоптической области гипоталамуса самая высокая концентрация люлиберина отмечается в диэструсе, самая низкая - в эструсе, в ходе проэструса она имеет промежуточное значение. В медиобазальном гипоталамусе концентрация люлиберина возрастает от диэструса к проэструсу, затем содержание нейропептида уменьшается, происходит овуляция и наступает эструс [11].
В плазме крови в течение цикла концентрация люлиберина изменяется незначительно. Существенные изменения прослеживаются только в проэструсе, когда концентрация люлиберина увеличивается почти в 1,5 раза. Концентрации ФСГ и ЛГ в крови крыс на стадии диэструса остаются практически постоянными и только в проэструсе концентрации гормонов увеличиваются в несколько раз, а с началом эструса уменьшаются до исходной величины [11]. Сходная динамика изменения содержания в плазме крови ФСГ и ЛГ прослеживается у свиней [185].
В ходе эстрального цикла меняется уровень не только ГРФ и гонадотропных гормонов, но и содержание других нейропептидов, в том числе опиоидных.
Так в перивентрикулярном и вентромедиальном ядрах гипоталамуса овец происходит существенное сокращение количества образующегося проэнкефалина в фолликулярную стадию и во время преовуляторного выброса ЛГ по сравнению с лютеальной стадией [263]. В антеровентрикулярных и перивентрикулярных ядрах преоптической области гипоталамуса в проэструсе происходит снижение уровня мРНК проэнкефалина относительно диэструса [246]. По другим данным уровень мРНК проэнкефалина в медиобазальном гипоталамусе крыс значительно увеличивался в проэструсе, оставался высоким до первого дня диэструса и возвращался к исходному уровню во второй день диэструса. Эти изменения были специфичны для вентромедиальных и вентролатеральных ядер гипоталамуса, в то время как в дорсомедиальных и аркуатных ядрах гипоталамуса такие изменения не наблюдались [155].
Уровень мРНК проэнкефалина значительно меняется в течение эстрального цикла в яичниках и матке (в 3-6 раз). Самая высокая концентрация мРНК проэнкефалина в яичниках крысы наблюдалась в эструсе, а в матке - в метаэструсе и диэструсе. В отличие от мРНК проэнкефалина мРНК ПОМК оставалась на одном уровне в ходе эстрального цикла и в яичниках, и в матке [174].
В нейронах антеровентрикулярного и паравентрикулярного ядер преоптической области самый низкий уровень мРНК продинорфина наблюдается на стадии проэструса [246].
Уровень иммунореактивного леуморфина в гипоталамусе и аденогипофизе крыс значительно выше в проэструсе, чем в эструсе и метаэструсе. Увеличение концентрации иммунореактивного леуморфина в проэструсе коррелирует с выраженностью полового поведения в течение эстрального цикла. Уровень иммунореактивного леуморфина не изменялся в гиппокампе и нейрогипофизе в ходе эстрального цикла [257].
Во время эстрального цикла меняется не только уровень экспрессии самих опиоидных пептидов, но и их рецепторов [162, 219]. Так плотность и характер распределения м-рецепторов в медиальной преоптической области гипоталамуса существенно изменялись в ходе эстрального цикла. Высокая концентрация м-рецепторов наблюдалась в центральной части медиальной преоптической области в метаэструсе и диэструсе. Обнаружено также, что в этой части мозга плотность и распределение м-рецепторов зависят как от стадии эстрального цикла, так и от пола животного. Интересно отметить, что для к-рецепторов такой закономерности не обнаружено [162]. Однако в работе [219] указывается на наличие изменений в ходе эстрального цикла и на отсутствие половых различий в распределении и плотности [3Н][D-ала,D-лей-5]-энкефалин-связывающих д-рецепторов в мозге хомяков. Эти данные указывают, на то что, скорее всего эндогенные и экзогенные опиоидные пептиды оказывают свое влияние на репродуктивную функцию через м- и к-рецепторы, но не через д-рецепторы [219].
Результаты многих работ указывают на то, что содержание эндогенных опиоидов и их рецепторов находится под влиянием стероидных половых гормонов [162, 163].
После внутрибрюшинного введения прогестерона овариоэктомированным крысам увеличивалось количество м-опиатных рецепторов в медиальной преоптической области, кроме того возрастало содержание мРНК ПОМК в нейронах, иннервирующих эту часть мозга [163]. В другой работе указывается, что увеличение количества м-рецепторов в медиальной преоптической области гипоталамуса крыс происходит только в случае совместного введения эстрадиола и прогестерона [202].
У овариоэктомированных мышей уменьшалась плотность м-опиатных рецепторов в вентролатеральной преоптической области. Однако, если у мышей с удаленными яичниками проводилась заместительная терапия половыми стероидными гормонами, то отличий в распределении м-опиатных рецепторов в мозге по сравнению с интактными животными не наблюдалось [176].
Такое вызванное гормонами изменение плотности м-рецепторов в преоптической области, вероятно, может влиять на физиологические эффекты, вызванные опиоидными пептидами, по отношению к секреции гонадотропинов и репродуктивному поведению самок крыс [202].
В яичниках крысы и хомяка 17-в-эстрадиол и прогестерон не влияли на уровень мРНК проэнкефалина. Однако прогестерон увеличивал синтез мРНК проэнкефалина в яичнике в 2-3 раза в случае предварительной обработки животных эстрадиолом [211].
В матке крысы и хомяка эстрадиол не оказывал значительного влияния на транскрипцию мРНК проэнкефалина, но при действии прогестерона уровень транскрипции, а также содержание проэнкефалина увеличивались. Глюкокортикоиды и андрогены оказывали действие, сходное с прогестероном. Интересно, что эстрадиол оказывал различное воздействие на экспрессию мРНК проэнкефалина, стимулированную прогестероном у крыс и хомяков. У крыс эстрадиол подавлял экспрессию мРНК проэнкефалина, а у хомяков два гормона действовали синергично, повысив в 15-16 раз содержание мРНК проэнкефалина [211].
Эти результаты указывают на существование обратной положительной связи между опиоидными пептидами, которые действуют через м-рецепторы и половыми стероидными гормонами, что представляется важным компонентом в сложных регуляторных процессах, которые управляют воспроизводством [176, 202].
В ходе эстрального цикла меняется уровень не только опиоидных, но и других нейропептидов. Так наиболее высокий уровень окситоцина в плазме крови крыс наблюдается в проэструсе. Содержание этого гормона уменьшалось в паравентрикулярных и супраоптических ядрах в проэструсе и эструсе по сравнению с диэструсом и увеличивалось в нейрогипофизе в проэструсе по отношению к эструсу и диэструсу [106].
Концентрация брадикинина, а также мРНК в2-рецепторов брадикинина и самих рецепторов в матке свиньи была наибольшей в эструсе. В матке крыс наибольшее количество в2-рецепторов кинина обнаружено в конце проэструса и эструсе [141].
Обнаружены циклические изменения в концентрации рецепторов ангиотензина II в яичниках: более высокое содержание рецепторов было в эструсе, по сравнению с диэструсом [240].
Циклические изменения уровня гонадотропных гормонов гипофиза по механизму обратной связи приводит к изменениям уровня половых стероидных гормонов. Так, известно, что уровень эстрогенов увеличивается в фолликулярную стадию цикла, достигая максимума, как правило, к середине проэструса, и к началу эструса уровень эстрадиола приближается к уровню, характерному для диэструса. В начале цикла отмечается сравнительно низкая концентрация прогестерона, однако в середине к началу пика ЛГ наблюдается увеличение концентрации прогестерона в плазме крови, после чего его концентрация снижается, но остается более высокой на стадии эструса по сравнению с диэструсом [12, 17, 45].
В регуляцию эстрального цикла помимо гонадотропных гормонов гипофиза, половых стероидных гормонов, опиодных пептидов вовлекаются и другие нейромедиаторные системы. Так, норадреналинэргические нейроны играют значительную роль в стимуляции секреции ЛГ, вызванной кастрацией или эстрогенным возбуждением циклического центра. Дофамин способен стимулировать высвобождение ЛГ за счет активного влияния на нейроны аркуатной области. Серотонинэргические нейроны могут выступать в роли как тормозящих, так и стимулирующих выделение ЛГ факторов [46].
Таким образом, в ходе эстрального цикла происходит изменение уровня гонадотропных гормонов, а также нейропептидов, основная функция которых не связана с половой системой. Интересно отметить, что энкефалины, в-эндорфин, вазопрессин и половые стероидные гормоны, уровень которых определяется гонадотропными гормонами, влияют на формирование и поддержание влечения к этанолу, развитие зависимости и толерантности [19, 74, 88]. Поэтому кажется вполне вероятным, что у самок крыс на разных стадиях эстрального цикла могут наблюдаться отличия в развитии и течении алкогольной интоксикации [5], которые отчасти связаны с функциональными особенностями ферментов, принимающих участие в обмене нейропептидов.

1.2.2. Ферменты обмена нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла

В ходе эстрального цикла наблюдаются изменения в уровне регуляторных пептидов, эти изменения связаны с перестройками в функционировании ферментных систем, участвующих в их синтезе и деградации [28, 41]. В связи с этим представляется интересным изучение активности ферментов обмена нейропептидов в ходе эстрального цикла в норме и при различных патологических состояниях, в том числе при острой алкогольной интоксикации.

De Gandarias и соавт. обнаружили, что активность растворимой формы тирозинаминопептидазы существенно увеличивается в гипоталамусе крысы в проэструсе по сравнению с другими стадиями. Активность мембраносвязанной формы не изменялась во всех изученных отделах мозга. Однако было обнаружено значительное повышение активности мембраносвязанной пуромицин-нечувствительной активности в гипоталамусе и гипофизе в проэструсе [126]. При исследовании фронтальной, париетальной, окципитальной коры, обонятельных луковиц, таламуса, гипоталамуса, гиппокампа, амигдалы, стриатума и гипофиза было обнаружено, что лизин- и лейцин-аминопептидазная активность в гипоталамо-гипофизарной системе наиболее высокая в проэструсе; лей-аминопептидазная активность возрастала также и в окципитальной коре. В других исследованных отделах мозга активность фермента не подвергалась изменениям в ходе эстрального цикла [124, 125, 126]. Отмечается, что аргинин-аминопептидазная активность повышалась во всех изученных отделах мозга крысы в проэструсе, относительно диэструса и эструса [128]. Активность аспартатаминопептидазы не изменялась в течение эстрального цикла во всех исследованных отделах мозга [124, 127]. В ходе эстрального цикла наиболее высокий уровень сывороточной окситоциназы у мышей отмечен в диэструсе по сравнению с эструсом и проэструсом [203].

Инъекция 17-в-эстрадиола приводила к умеренному увеличению активности цистеинариламидазы независимо от стадии цикла и эндогенного уровня гормонов. Самая значительная активация фермента в гипоталамусе в ответ на применение прогестерона происходила в такие периоды цикла, когда содержание эндогенного прогестерона было низким. При введении внутрь желудочков головного мозга ЛГ или простогландина Е2 во время различных стадий цикла максимальное увеличение активности наблюдалось в диэструсе. По мнению авторов, цистеинариламидаза, вероятно, играет модулирующую роль в регуляции тонической секреции ЛГ в течение эстрального цикла, но, очевидно, не влияет на ациклическую секрецию ЛГ [187].

Уровень активности пролилэндопептидазы и эндопептидазы-24.15 существенно не изменялся в ходе эстрального цикла, хотя наблюдалась тенденция к снижению пролилэндопептидазной активности во время преовуляторного пика ЛГ. Снижение активности пролилэндопептидазы наблюдалось у овариоэктомированных овец, у которых повышение концентрации ЛГ было вызвано экзогенными эстрогенами по сравнению с контрольной группой овец. Эти данные свидетельствуют о возможном наличии отрицательной обратной связи между активностью пролилэндопептидазы и уровнем эстрадиола. Возможно, что подобная связь существует и между активностью эндопептидазы-24.15 и гонадными стероидными гормонами, так как после овариоэктомии активность фермента в аденогипофизе, медиальных и латеральных преоптических ядрах увеличивалась [105]. Введение ингибитора эндопептидазы-24.15 - N-[1(R,S)-карбокси-3-фенилпролил]-ала-ала-тир-п-аминобензоата не влияло на секрецию ЛГ. Кроме того, введение ингибиторов пролилэндопептидазы - бацитрацина или более специфичного - Z-пропролинала также не вызывало изменений в секреции ЛГ [190].
Обнаружено, что в ГГНС системе мышей экзогенные тестостерон и прогестерон вызывали, в основном, снижение активности КПН и ФМСФ-КП. Изменение активности исследуемых ферментов при введении половых стероидных гормонов зависели от пола животного и времени после инъекции и, практически, не зависели от дозы вводимого гормона. Наиболее существенное изменение активности КПН и ФМСФ-КП при введении тестостерона и прогестерона выявлено в гипофизе и половых железах у животных обоего пола. Минимальное влияние половых стероидных гормонов на активность ферментов обнаружено в гипоталамусе [78, 256].
Пептидгидролазная активность, способная инактивировать ГРФ, в гипоталамусе была понижена в проэструсе и в первый день диэструса по сравнению с другими стадиями эстрального цикла крыс. Уменьшение такой активности в проэструсе по мнению авторов способствует накоплению ГРФ и ЛГ перед преовуляторным пиком этих гормонов. Сниженная пептидазная активность в гипофизе в первый день диэструса возможно уменьшает деградацию синтезирующихся в нем рецепторов ГРФ, которые синтезируются до проэструса [216].
Общее количество АПФ не изменяется в яичниках крыс в течение эстрального цикла. Растущие и атретические фолликулы характеризуются высоким уровнем АПФ, хотя в преовуляторных фолликулах АПФ либо отсутствует, либо его уровень очень низок. Возможно, что АПФ участвует в ранних стадиях фолликулярного созревания и атрезии [121]. Активность мембраносвязанной формы АПФ в матке крупного рогатого скота значительно выше в диэструсе, чем в эструсе [239]. Активность АПФ в фаллопиевых трубах свиньи была выше в ампулярной части, чем в перешейке независимо от стадии эстрального цикла. В свою очередь, в перешейке фаллопиевых труб наблюдались периодические изменения активности АПФ в ходе цикла: в эструсе и метаэструсе активность была выше, чем в проэструсе [138]. Высокий уровень экспрессии мРНК и высокая активность АПФ обнаружены в конце секреторной фазы в эндометрии матки человека. Предполагается важная роль АПФ в инициации менструации [191].
Высокая концентрация проренина обнаружена в фолликулах яичника человека в середине менструального цикла. У кошек общее количество ренина в яичниках было самым низким в анэструсе, увеличивалось в эструсе и становилось еще большим в период овуляции [235]. Активность плазматического ренина у крыс была увеличена в эструсе по сравнению с проэструсом и диэструсом [130]. Но такие изменения не наблюдались, если крысы были овариоэктомированы. При совместной обработке эстрадиолом и прогестероном таких крыс содержание проренина изменялось подобно тому, как оно менялось в эстральном цикле у интактных животных [130].
Экспрессия мРНК пролилолигопептидазы и активность этого фермента в яичниках крыс увеличивается в лютеальную фазу, что позволяет предположить наличие связи олигопептидазы с формированием и/или регрессией желтого тела [184]. КПМ не обнаруживается в гранулярных клетках растущих и незрелых фолликулов, но появляется в больших количествах на поверхности гранулярных клеток, обработанных лютеинизирующим гормоном, и во время овуляции; обнаруживается в клетках жёлтого тела во время менструации и на ранних стадиях беременности [267].
Таким образом, протеолитическим ферментам, вероятно, принадлежит важная роль в регуляции уровня биологически активных пептидов в организме, а также в различных физиологических процессах, связанных с функцией размножения.

1.3. Этанол и его влияние на пептидэргические системы

1.3.1. Влияние этанола на уровень нейропептидов в организме

Острая и хроническая алкогольная интоксикация приводит к изменению уровня и/или соотношения уровней многих нейропептидов, что можно рассматривать в качестве одного из первичных патогенетических факторов алкоголизма [88, 186].

Изменение эндогенной опиатной системы у экспериментальных животных при однократном и хроническом контакте с этанолом показано в ряде работ. Однако вследствие использования в них неидентичных фармакологических моделей и антисывороток различной специфичности результаты этих исследований не отличаются однородностью. Так K. Blum описал снижение суммарного содержания энкефалинов и позднее лей-энкефалина в базальных ганглиях мозга золотистых хомячков после добровольного потребления этанола в течение года [102]. В то же время другие авторы не выявили каких-либо изменений в уровне мет-энкефалина в гипоталамусе и лей-энкефалина в стриатуме, гипоталамусе и коре мозга после острого и хронического введения этанола [110, 236]. В то же время указывается на значительное повышение уровня мет-энкефалина в стриатуме в результате однократной инъекции этанола в дозе 2,5 г/кг и выраженное снижение содержания этого пептида в стриатуме, в суммарном препарате продолговатого мозга и моста, в среднем мозге после 4-недельного принудительного введения 20% этанола [241].

Эти данные нашли свое подтверждение в работах Seizinger и соавт., исследовавших региональный уровень б-неоэндорфина, динорфина и мет-энкефалина в мозге крыс после хронического введения этанола в виде компонента жидкой диеты. Такой вид алкоголизации вызывал резкое снижение содержания мет-энкефалина в стриатуме и гипоталамусе, но уровень пептида в среднем мозге и гиппокампе оставался неизменным. Иммунореактивность динорфина и б-неоэндорфина уменьшалась более чем на 50% в гипоталамусе и гиппокампе, но не изменялась в среднем мозге, стриатуме, аденогипофизе и нейроинтермедиальной его доле [243]. Параллельность изменений динорфина и б-неоэндорфина, очевидно, обусловлена наличием у них общего предшественника (проэнкефалина В), в то время как мет-энкефалин является дериватом другого пептида - проэнкефалина А [72, 166].

Стабильное содержание динорфин/б-неоэндорфина в стриатуме в условиях алкоголизации гарантирует и поддерживает нормальную продукцию лей-энкефалина. Неизменный уровень лей-энкефалина на фоне сниженного содержания мет-энкефалина демонстрирует дезинтегрирующие свойства этанола на центральные энкефалинэргические системы мозга. Вероятно, алкоголизация снижает скорость биогенеза мет-энкефалина и увеличивает интенсивность его ферментативной деградации [19, 165].

Большинство исследователей указывают на отсутствие изменений или незначительное снижение иммунореактивности в-эндорфина в гипофизе крыс после однократной инъекции этанола [241, 243]. Однако Gianoulakis и соавт. отмечают значительное снижение в-эндорфин подобной иммунореактивности в аденогипофизе, но не в нейропромежуточной доле [159].

Небольшое уменьшение гипофизарного пула в-эндорфина и повышение его в гипоталамусе на 30% после 14 дней потребления 10% раствора этанола в качестве единственного источника жидкости обнаружили Cheng и соавт.[110], а при употреблении крысами 20% раствора уровень в-эндорфина в промежуточной доле гипофиза крыс снижался более чем на 70% [241]. Повышение уровня в-эндорфина в гипоталамусе после однократной инъекции этанола и снижение его при хроническом потреблении позволяет предположить участие гипоталамических эндорфинэргических путей в реализации эмоциогенных эффектов этанола, причем дифференцированность этой реакции может быть расценена как проявление эмоционально позитивных (острое введение) и эмоционально негативных (хроническое введение) свойств этанола [19].

При однократном введении крысам 20% раствора этанола внутрибрюшинно в дозе 4 г/кг в надпочечниках уже через 15 минут происходило снижение уровня мет-энкефалина, через 1 час после введения этанола величина этого показателя существенно превышала контрольный уровень, а через два часа соответствовала контрольным значениям. В плазме крови животных сразу же после инъекции этанола наблюдалось некоторое повышение концентрации мет-энкефалина, но через 2 часа уровень его был достоверно ниже по сравнению с контролем. Авторы приходят к выводу, что в действии этанола на метаболизм энкефалинов в системе надпочечники - кровь можно выделить 2 фазы: первая характеризуется усиленным высвобождением мет-энкефалина из надпочечников в кровь на фоне неизменной скорости образования пептида, вторая - угнетением высвобождения мет-энкефалина на фоне сначала усиленного, а затем пониженного его образования в ткани надпочечников [15].

Острая алкогольная интоксикация приводила к значительному повышению [94, 159, 222, 261], а хроническая - к уменьшению уровня плазматического в-эндорфина у крыс [94, 104].

Уровень мРНК ПОМК в гипоталамусе крыс возрастал при хронической алкоголизации [95] и значительно уменьшался в случае острой алкогольной интоксикации [268].

Хроническая алкоголизация крыс повышает скорость синтеза de novo ПОМК и пептидов, связанных с в-эндорфином, в промежуточной доле и в аденогипофизе. Несмотря на это, отношение в-эндорфина, определяемого при помощи моноклональных антител к суммарному в-эндорфину + в-ЛПГ резко снижено в передней доле [243].

Считается, что пул биологически активного в-эндорфина уменьшается в обеих долях гипофиза алкоголизированных крыс, но за счет различных механизмов: в аденогипофизе путем замедления энзиматического образования в-эндорфина из предшественника интермедиата в-ЛПГ, а в промежуточной доле - за счет усиления инактивационных преобразований [243].

Острая алкогольная интоксикация самок овариоэктомированных крыс приводит к значительному уменьшению содержания в-эндорфина и мет-энкефалина в гипоталамусе. К тем же результатам приводит подкожное введение эстрадиола. Совместное введение этанола и эстрадиола способствует снижению уровня мет-энкефалина в гипоталамусе и увеличению уровня этого пептида в среднем мозге и гиппокампе, коре больших полушарий. Уровень в-эндорфина в этих условиях понижался в гипоталамусе и среднем мозге. Приведенные результаты показывают, что эстрадиол может значительно модифицировать ответную реакцию опиоидэргической системы на действие этанола [107].

В реестре эндокринопатий, вызываемых введением этанола, первое место занимает поражение ГГГС [19]. Однако литературные данные, касающиеся уровня гонадотропных гормонов при алкогольной интоксикации, достаточно противоречивы. Так, отмечено, что единичный прием спирта в дозе 0,5-1,5 г/кг массы тела повышал концентрацию ЛГ в крови мужчин [135, 207], не изменял ее [86, 135] или снижал [86]. Аналогичные результаты получены для женщин [135, 208]. Более детально влияние этанола на ГГГС исследовано на животных [108]. У них обнаружена четкая связь между дозой вводимого этанола и степенью снижения концентрации ЛГ. В ряде опытов после однократной инъекции зафиксировано уменьшение этого показателя практически до неизмеримой величины [86].

Острая алкогольная интоксикация крыс в проэструсе отменяет преовуляторный пик ЛГ и овуляцию за счет подавления активности ядер гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГРФ, что в свою очередь приводит к снижению концентрации ГРФ в проэструсе. Экзогенное введение ГРФ крысам, подвергшихся острой алкогольной интоксикации, вызывало увеличение секреции ЛГ и овуляцию [179].

Инъекция этанола крысам в дозе 0,5-3 г/кг приводила к значительному снижению плазматического уровня ЛГ, причем у самок эти изменения были выражены сильнее, чем у самцов [231]. В то же время уровень ФСГ у опытных животных достоверно не отличался по сравнению с контрольными [231].

Самки крыс, у которых секреция ЛГ была стимулирована кастрацией или введением налоксона, этанол вызывает значительное снижение концентрации гормона в плазме крови. Депрессивный эффект этанола по отношению к гонадотропинам у кастрированных крыс снимается введением ГРФ [115].

Наиболее вероятно, что эффект реализуется в гипоталамусе, так как однократное введение этанола не изменяет ответа на ГРФ у здоровых добровольцев и животных [189]. Нормальный ответ может быть достигнут даже при очень высоких дозах спирта [248]. Все эти данные, а также прямое измерение концентрации ГРФ в портальной крови гипофиза после введения этанола подтверждает тезис о том, что в данной экспериментальной ситуации нарушается функция гипоталамуса [123]. Снижение высвобождения ГРФ при острой алкогольной интоксикации определяется, вероятно, наличием опиодной активности у этанола [207].

Однако в работе, проведенной на самках макак-резусов, было показано, что при острой алкогольной интоксикации уровень ФСГ в плазме крови не изменяется в ответ на введение синтетического аналога ГРФ. Вероятно, за счет этого этанол нарушает нормальное созревание фолликулов яичника, приводит к неадекватному протеканию послеовуляторной фазы цикла или ановуляции, что часто наблюдается у женщин с алкогольной зависимостью и у животных со смоделированным алкоголизмом [206].

К изменениям в функционировании ГГГС приводит и хроническая алкогольная интоксикация. Повышенное содержание пролактина отмечено практически у всех больных алкоголизмом и у здоровых мужчин после острого введения этанола [66, 67, 206], сходные данные получены относительно самок крыс [257].

В сравнении с контрольной группой у мужчин с хронической интоксикацией алкоголем выявлено понижение содержания ФСГ [67] и ЛГ [135] в плазме крови, по другим данным содержание ЛГ достоверно не отличается от контрольной группы [66].

У самцов крыс после хронической алкогольной интоксикации уровень ФСГ и ЛГ в плазме крови более чем в 2 раза снижался по сравнению с контрольными животными, в то время как в гипофизе уровень этих гормонов был сходен с контролем [238], у самок крыс в этих условиях наблюдалось уменьшение уровня ЛГ, при неизменном уровне ФСГ [257].

Однократное поступление алкоголя в организм сопровождается повышением активности ГГНС: усиливается образование катехоламинов [88], КРФ [80], в-эндорфина [94, 159, 222, 261], кортикостероидов [80, 230]. Эффект, вероятно, реализуется на самых высоких уровнях регуляции этой оси, так как снимается гипофизэктомией или введением антисыворотки к КРФ и обусловлен в значительной мере специфической мембранотропной активностью этанола [86], что подтверждается экспериментами in vitro. Этанол дозозависимо увеличивал освобождение АКТГ из суперфузируемых аденогипофизов мыши и фрагментов аденогипофизов крысы [228]. При этом отмечено снижение чувствительности рецепторов к КРФ, что можно трактовать как дополнительный стимул к секреции этого фактора in vivo. In vitro этанол влияет и на продукцию КРФ гипоталамусом, причем в концентрациях, соответствующих содержанию этилового спирта в тканях in vivo. Эффективны также дозы на порядок выше [227, 228]. Интересно отметить, что секреция гипофизом АКТГ в ответ на различные дозы этанола была многофазной и включала в себя 3 пика. Так как АКТГ и в-эндорфин выделяются обычно совместно, можно предположить, что в-эндорфин, подобно АКТГ, имеет волнообразную динамику секреции. Вероятно, это может частично объяснить несогласованность результатов различных лабораторий относительно влияния этанола на уровень в-эндорфина [158].

При острой алкогольной интоксикации, а также на ранних стадиях развития алкоголизма наблюдается увеличение уровня плазматического АКТГ у людей и животных [158, 230]. Причем у самок секретируется больше АКТГ и кортикостероидов, чем у самцов в ответ на одинаковую дозу этанола [217]. Кроме того, ответ ГГНС на алкоголь был меньше у интактых самцов по сравнению и с другими феминизированными группами (гонадэктомированными самцами и самками). У самок крыс при острой алкогольной интоксикации более высокая концентрация АКТГ и кортикостероидов в плазме крови наблюдается в течение проэструса и эструса по сравнению с диэструсом [230].

Однако длительная гиперфункция ГНС при значительных сроках алкоголизации сменяется у большинства особей снижением содержания АКТГ и кортикостероидов в плазме крови, что связано с истощением ГНС [232]. Так у крыс, с хронической алкогольной интоксикацией, концентрация АКТГ в плазме крови составляла примерно половину от контрольного уровня [191].

Хроническое потребление этанола животными (в течение 7 недель) снижало уровень нейропептида Y, обладающего анксиолитическими свойствами, в гипоталамусе [136, 137, 173, 252]. Однократное введение этанола в дозе 1г/кг внутрибрюшинно приводило к увеличению содержания ДСИП в стриатуме [22], таламусе [22, 93] и среднем мозге [22]. Увеличение дозы этанола приводило к снижению эффекта. Хроническое введение этанола изменяет как синтез ДСИП в мозге, так и поражает системы, через которые он реализует свое действие синхронизатора биоритмов [22]. Острая алкогольная интоксикация приводит к подъему уровня гастрина и снижению уровня инсулина в крови. В случае хронической алкогольной интоксикации наблюдалось повышение уровня гастрина, нейротензина, вещества Р и снижение уровня инсулина, соматотропного гормона, окситоцина, вазопрессина в плазме крови [3, 4].

Однако не стоит забывать, что алкогольная интоксикация воздействует не только на пептидэргическую систему, но и вызывает дисфункции в других нейромедиаторных системах: дофаминовой, серотониновой, ГАМК-ергической, холинергической и др.[19, 80, 88].

Так большинство исследователей склоняются к мысли о том, что под влиянием однократного введения этанола кругооборот дофамина и серотонина в мозгу ускоряется. Исследования в области прижизненной визуализации мозга показали увеличение концентрации дофамина в мозговой системе “вознаграждения”. Ряд авторов считает, что изменения дофаминовой нейромедиации является основным звеном формирования алкогольной зависимости [80, 88].

Алкоголь вызывает повышение активности главной тормозящей системы мозга - ГАМКэргической. Доказано, что этанол влияет на комплекс рецептор ГАМКА/хлорный канал, вызывая значительное повышение входа Cl- внутрь клетки. Замечено, что стероидные гормоны способны оказывать модулирующее влияние на функцию ГАМКА, что может объяснить некоторые половые различия в молекулярных эффектах этанола [80, 88, 120].

Этанол специфически и селективно изменяет синаптическое действие глутамата - основного возбуждающего нейротрансмиттера мозга. Алкоголь в концентрации 0,03% ингибирует поток ионов через NMDA - рецептор в культуре нервных ткани [80]. Этанол вызывает дозозависимое угнетение высвобождения ацетилхолина в различных структурах мозга in vitro и in vivo, а также торможение вхождения ионов Na+ в клетку. Холинэргические синапсы коры мозга более устойчивы к действию этанола, чем синапсы подкорковых структур. При посмертном исследовании мозга алкоголиков найден сниженный уровень норадреналина в различных структурах мозга. У животных потребление этанола повышает уровень активности норадренэргических нейронов [80].

Таким образом, алкоголь модифицирует деятельность всех эндокринных желез, что приводит к качественным и количественным изменениям метаболизма многих нейромедиаторов [8, 19, 62]. Однако стоит отметить, что данные об уровне различных нейромедиаторов весьма противоречивы, что, вероятно, связано с особенностями проведения эксперимента.

1.3.2. Влияние этанола на активность ферментов обмена нейропептидов
Под влиянием этанола отмечаются нарушения в функционировании ферментных систем, в том числе тех, которые участвуют в образовании и инактивации нейропептидов [26, 31, 36]. Последние в свою очередь напрямую или опосредованно могут влиять на предпочтение к этанолу, развитие толерантности, а также вовлекаются в ответную реакцию организма на алкогольную интоксикацию. Поэтому очень важным представляется исследование активности ферментов обмена нейропептидов при алкогольной интоксикации.
Mayas и соавт. изучено влияние этанола на активность аминопептидаз синаптосом головного мозга мышей in vitro. Под действием этилового спирта дозозависимо ингибировалась аланинаминопептидаза; активность аргинин-, цистеин-, лейцин-, тирозинаминопептидазы под действием малых доз этанола увеличивалась, большие дозы оказывали противоположный эффект. Инкубация синаптосом в среде 25 мМ К+ в присутствии этанола приводит к ингибированию всех исследованных аминопептидаз [205].
При хронической алкогольной интоксикации содержание мРНК АПФ и нейтральной эндопептидазы заметно уменьшается в мозге мышей [265]. Имеются данные о том, что активность нейтральной эндопептидазы в сыворотке крови людей коррелирует с количеством потребляемого алкоголя [142], выявлено увеличение активности ренина в плазме крови у лиц в состоянии алкогольного опьянения [63]. Активность катепсина А и D у людей с острой алкогольной интоксикацией не изменялась по сравнению с контролем, в то время как она увеличивалась в сыворотке у хронических алкоголиков [178].
Хроническое потребление этанола самцами крыс приводит к снижению активности АПФ в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме, что может способствовать повышению уровня опиоидных и стресс-пептидов [31]. Острая алкогольная интоксикация ведет к изменению активности КПN в сыворотке крови крыс, причем эти изменения зависят от дозы вводимого этанола. При остром и хроническом потреблении этанола животными наблюдается достоверное повышение активности энкефалиназы А в стриатуме, гипоталамусе и среднем мозге. Авторами работы высказывается предположение, что нарушения деградации энкефалинов играют ключевую роль в реализации действия этанола на энкефалинэргическую систему мозга [76] Через 6 часов после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 1г/кг происходило повышение активности КПН в гипофизе, гипоталамусе, среднем мозге и стриатуме. В сером веществе и гиппокампе активность фермента не изменялась. Введение этанола в дозе 4 г/кг вызывало повышение активности фермента в гипофизе, гипоталамусе и сером веществе; в среднем мозге и стриатуме активность не изменялась [26]. В другой работе указывается, что у самцов крыс, которым вводили внутрибрюшинно этанол в дозе 4 г/кг через 3 и 6 часов после его введения отмечено повышение удельной активности энкефалинконвертазы в коре мозга и среднем мозге; в гиппокампе изменения активности фермента носили синусоидальный характер [14]. Хроническое потребление этанола вызывало снижение активности КПН в гипофизе [25, 26], гипоталамусе [26], стриатуме [26, 36], коре мозга и среднем мозге [14]. Во всех исследованных отделах активность мембраносвязанной формы изменялась более значительно, чем растворимой, что, вероятно, связано с мембранотропным эффектом этанола [256].
Достоверные изменения активности КПМ при хроническом потреблении этанола выявлены в гиппокампе, где активность КПМ увеличивается, но снижается в больших полушариях, не обнаружено достоверных отличий в активности фермента в гипоталамусе, стриатуме и четверохолмии [36]. Хроническая алкоголизация существенно влияла на активность ФМСФ-КП: активность фермента повышалась в гипоталамусе, стриатуме, четверохолмии, то есть тех отделах головного мозга, в которых при алкоголизации наблюдаются наиболее существенные изменения уровня энкефалинов и некоторых других нейропептидов. Активность ФМСФ-КП при хронической алкогольной интоксикации осталась на прежнем уровне в гиппокампе и больших полушариях [36].
Интересные данные о влиянии внутрибрюшинного введения самцам крыс физиологического раствора на активность ферментов обмена нейропептидов приводятся в работе Вернигоры и соавт. [38]. Ими обнаружено повышение активности КПН в гипофизе и стриатуме, АПФ в гипофизе и сыворотке крови, КПN в сыворотке. Эти ферменты участвуют в обмене целого ряда НП, поэтому внутрибрюшинное введение физраствора может приводить к значительным изменениям в функционировании пептидэргических систем. Причем эти изменения затрагивают стресс-систему, опиоидэргическую и ангиотензин-брадикининовую систему. Поэтому при проведении острых экспериментов необходимо рассматривать все наблюдаемые явления с учетом изменений, вызванных внутрибрюшинной инъекцией [38]. В ряде работ указывается, что, по-видимому, КПН, КПN и АПФ вовлекаются в реализацию стресс-протективного действия этанола [26, 40].
Таким образом, этанол вызывает изменение активности ряда протеолитических ферментов. Это, в свою очередь, ведет к изменению уровня многих регуляторных пептидов, что можно рассматривать как один из патогенетических факторов алкоголизма.

1.4. Карбоксипептидаза H (КФ 3.4.17.10)

КПH (КПE, энкефалинконвертаза) впервые выделена и охарактеризована Fricker и Snyder из хромаффинных гранул надпочечников быка, как фермент, образующий энкефалины из их предшественников [152]. Позднее фермент был выделен и очищен из мозга [34, 153, 154], гипофиза [153, 154], островков Лангерганса поджелудочной железы [122, 133, 161, 198]. Фермент, выделенный из разных тканей разных видов животных, имеет очень близкие физико-химические и каталитические свойства.
КПH является одноцепочечным гликопротеином и существует как в растворимой, так и в связанной с мембранами формах [34, 122, 197]. Существуют две формы мембраносвязанной КПH, отличающиеся по прочности связывания с мембранами. Одна из этих форм экстрагируется из мембран при pH 5,6 1 M раствором NaCl, вторая - только при совместном воздействии 1 M NaCl и 1% Тритона X-100 [147, 258].
Фермент синтезируется в виде неактивного зимогена с Mr 75000 [209], который превращается в активную форму под действием трипсиноподобных ферментов в ходе созревания секреторных везикул [140, 161]. Сначала образуется неактивная форма с Mr 65000 [168, 169], которая превращается в активные формы с Mr 52000 - 53000 и 55000 - 57000 [140, 161, 220]. Отличия в Mr этих форм не связаны с различиями в степени гликозилирования [161, 220, 221]. Форма с Mr 55000 - 57000 отличается от формы с Mr 52000 - 53000 наличием N-концевого сигнального пептида [220]. Обе формы существуют и в растворимом, и в связанном с мембранами виде [161, 140]. Активность растворимой формы фермента в расчёте на молекулу фермента выше, чем мембраносвязанной [143, 147]. Соотношение между растворимой и мембраносвязанной формами изменяется по мере созревания секреторных везикул [171]. За связывание фермента с мембранами отвечает C-концевая амфифильная последовательность, которая присутствует только у мембраносвязанной формы [147]. Она состоит из 21 остатка чередующихся гидрофобных и гидрофильных аминокислот. В аминокислотной последовательности КПH обнаружен также Ca2+-связывающий участок [213], но ионы Ca2+ влияют не на активность, а на стабильность, агрегацию и способность к связыванию с мембранами [255].
КПН проявляет максимальную активность при рН 5,5-6,0, что соответствует рН внутри секреторных везикул и является тиолзависимым металлоферментом, в активном центре которого находится ион Zn2+ [149, 153]. Данный фермент сильно (примерно в 5-10 раз) активируется ионами Со2+, в меньшей степени (в 2-3 раза) - ионами Ni2+, ингибируется ионами Сd2+ и Cu2+, хелатирующими агентами: ЭДТА, о-фенантролином, при применении которых активность фермента восстанавливается добавлением ионов Zn2+. Фермент также ингибируется реагентами на сульфгидрильные группы: ПХМФС, ПХМБ, N-этилмалеимидом и органическими кислотами, содержащими амино- или гуанидиновую группу: ГЭМЯК, ГПЯК, АПМЯК, АПЯГ, МГТК. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с Кi 8,8 и 7,5 нМ соответственно.
ФМСФ, 2-меркаптоэтанол, а также ионы Мg2+ и Mn2+ не влияют на активность КПН [149, 152, 153, 167, 258].
КПH отщепляет остатки аргинина и лизина с C-конца синтетических и природных пептидов. Скорость отщепления остатков аргинина в несколько раз больше, чем остатков лизина. Остатки гистидина отщепляются с очень маленькой скоростью, по сравнению с остатками лизина. Остатки ароматических аминокислот не отщепляются. Скорость расщепления субстратов зависит от предшествующего аминокислотного остатка. Скорость расщепления дансил-фен-ала-арг на порядок выше, чем скорость расщепления дансил-фен-гли-арг, дансил-фен-лей-арг и дансил-фен-иле-арг [167, 172, 234, 254].
Локализация фермента в целом соответствует распределению биологически активных пептидов и их предшественников [50, 144, 145]. Наиболее высокая активность КПH обнаружена в аденогипофизе, хромаффинных гранулах надпочечников [152, 153, 154] и островках Лангерганса поджелудочной железы [122, 161]. Более низкая (примерно на порядок) активность фермента обнаруживается в задней доле гипофиза [172, 177], гипоталамусе, стриатуме, гиппокампе, среднем мозге, коре больших полушарий [89]. Наиболее низкая активность КПH обнаружена в стволовой части головного мозга, спинном мозге, легких, сердце, желудочно-кишечном тракте, печени и почках. Установлено, что КПH ассоциирована со структурными элементами ЭПР, комплекса Гольджи и секреторными везикулами, где протекает процессинг предшественников различных биологически активных пептидов [144]. Фермент обнаружен в секреторных везикулах, содержащих энкефалины [196], атриальный натрийуретический фактор [197], глюкагон [161, 218], инсулин [122, 133], АКТГ [134, 201], пролактин [150], вещество P [111], вазопрессин и окситоцин [214, 234] и другие регуляторные пептиды. Различные ингибиторы и активаторы секреции координировано регулируют выделение КПH и энкефалинов [151, 170], АКТГ [182, 183, 201], пролактина [150], вазопрессина [103, 200] и инсулина [160].
Физико-химические свойства, субстратная специфичность, тканевая, клеточная и субклеточная локализация, особенности изменения активности фермента при различных фармакологических воздействиях на культуры клеток, нарушение синтеза нейропептидов у мышей с дефектной КПН свидетельствуют о том, что исследуемый фермент вовлекается в процессинг многих биологически активных пептидов, таких как энкефалины, АКТГ, -эндорфин, вазопрессин, окситоцин, нейротензин, меланоцитстимулирующий гормон, вещество Р и др.
Показано, что КПН вовлекается в определение агрессивности [52], предрасположенности к потреблению этанола[56], в развитие физической зависимости от этанола[14, 49, 52, 55], в ответ на различные стрессирующие воздействия [30, 33, 48, 52], введение стероидных гормонов in vivo [39], имеются данные о наличии половых различий в активности фермента [78].

1.5. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза

В 1995 г. Вернигора и соавт. обнаружили в растворимой фракции серого вещества головного мозга кошки основную КП, активность которой полностью подавляется ФМСФ [42].
Фермент, по результатам гель-фильтрации, имеет Мr 100000; проявляет максимальную активность при рН 6,0-6,5, но сохраняет 40-45% активности при рН 5,5. Фермент полностью ингибировался ФМСФ и ПХМБ, примерно на 40% ингибировался иодацетамидом. ЭДТА, 2-меркаптоэтанол, N-этилмалеимид, ионы Co2+ и ГЭМЯК не влияли на его активность. Фермент почти в 2 раза активировался 50 мМ NaCl, несколько слабее - NaBr, KCl и KJ. Повышение концентрации NaCl не приводило к увеличению степени активации фермента [42, 47].
Согласно данным тонкослойной хроматографии частично очищенный фермент отщеплял аргинин от лей5-энкефалин-арг6 и дансил-фен-лей-арг с образованием лей5-энкефалин и дансил-фен-лей соответственно. Более глубокого гидролиза субстратов не наблюдалось. Фермент также не расщеплял субстрат КПA - карбобензокси-гли-лей [42, 47]. Таким образом, по субстратной специфичности ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза сходна с ЛКПB. Вместе с тем физико-химические свойства фермента (ингибирование ФМСФ, нечувствительность к ЭДТА, ГЭМЯК и ионам Co2+) отличают его от ЛКПB [1, 192]. Ингибирование фермента ФМСФ позволяет предположить, что он является сериновой карбоксипептидазой. В тканях млекопитающих обнаружены две сериновые карбоксипептидазы - ЛКПА (КФ 3.4.16.1, катепсин A, лизосомальная карбоксипептидаза L) и карбоксипептидаза C (КФ 3.4.12.4, ангиотензиназа C, пролилкарбоксипептидаза). Но ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза отличатся от карбоксипептидазы C по молекулярной массе и субстратной специфичности [226, 249].
В то же время, ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза имеет сходные с ЛКПA молекулярную массу, оптимум pH, ингибиторный профиль, но отличается от последней по субстратной специфичности и тканевой локализации [204, 226].
Активность ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена во всех отделах мозга и в большинстве тканей, за исключением почек, в которых присутствуют лишь следы ее активности. Наибольшая активность фермента отмечается в надпочечниках, примерно на 40% ниже - в гипофизе, в печени и селезенке его активность составляет примерно 30-35% от активности в гипофизе. В семенниках активность ФМСФ-ингибируемой КП примерно в 2,5 раза ниже, чем в надпочечниках. В отделах мозга активность фермента примерно в 2-3 раза ниже, чем в гипофизе. Наиболее высокая активность ФМСФ-ингибируемой КП в мозге обнаруживается в обонятельных луковицах, наиболее низкая - в четверохолмии и гиппокампе [35].
Обращает на себя внимание тот факт, что сродство обнаруженного фермента к дансил-фен-лей-арг (Кm гидролиза - 48 мкМ), выше, чем сродство КПН (Кm гидролиза - 96 мкМ). Это позволяет предположить, что энкефалин-лей5-арг6 может быть лучшим субстратом для ФМСФ-ингибируемой КП, чем для КПН. ФМСФ-КП проявляет существенную активность при значениях рН, соответствующих таковому внутри секреторных везикул. Таким образом, возможно, что обнаруженный фермент вовлекается в процессинг нейропептидов, в частности энкефалин-лей5-арг6, тем более, что в литературе имеются данные о том, что региональное распределение КПН и энкефалинов не всегда соответствует друг другу [75].
ФМСФ-КП вовлекается в развитие алкогольной зависимости [36, 37], в ответ на различные стрессирующие воздействия [13], обнаружены половые различия в активности ФМСФ-КП, причем у самок активность фермента во многих тканях выше, чем у самцов [44, 91, 139].
1.6. Карбоксипептидаза M (КФ 3.4.17.2)
Карбоксипептидаза M представляет собой мембраносвязанный одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой 62 кДа, заякоренный в плазматической мембране при помощи остатка гликозил-фосфатидилинозитола [123, 248]. Обработка трипсином и фосфолипазой C приводит к удалению гидрофобного хвоста и высвобождению фермента из клеточной мембраны [121, 250].
Высвобождение КПM из плазматической мембраны происходит и in vivo, поскольку фермент обнаружен в различных биологических жидкостях, в частности в моче и амниотической жидкости [250].
При химическом дегликозилировании образуется полипептид с Mr 48000, который состоит из 439 аминокислотных остатков [245, 251]. Аминокислотная последовательность фермента на 41% идентична КПN и КПH, на 15% - КПB и КПA. Многие остатки активного центра идентичны таковым КПA и КПB, но перекрёстной реакции с антисыворотками к другим КП фермент не даёт [251, 260].
Фермент отщепляет остатки только основных аминокислот, при отсутствии ионов Co2+ предпочтительней отщепляет аргинин, а в присутствии Co2+ - лизин. Эстеразная активность фермента значительно выше, чем пептидазная [123, 248]. КПM проявляет максимальную активность при pH 7,0, ионы Co2+ повышают активность фермента в 1,5-2 раза, причём степень активации возрастает при снижении pH [123]. Активность КПM подавляется ионами Cd2+, о-фенантролином, МГТК и ГЭМЯК [123, 248].
ПХМФС, HgCl2, дитиотреитол, ФМСФ, апротинин, каптоприл и фосфорамидон не влияют на активность фермента [123, 248].
Фермент локализован преимущественно в плаценте, почках, эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, обнаружен в периферической нервной системе и головном мозге[123, 212].
КПМ in vitro отщепляет С-концевые остатки основных аминокислот от динорфина А 1-13, мет-энкефалин-арг6, мет-энкефалин-лиз6, лей-энкефалин-арг6, брадикинина [1, 123, 248,], фактора роста эпидермиса [175], образует интактные кинины и анафилотоксины С3а, С4а, С5а [223]. Предполагают, что фермент может инактивировать или модулировать пептидные гормоны перед или после взаимодействия последних с рецепторами [28].
Стоит отметить, что если физико-химические свойства КПН, ФМСФ-КП и КПМ изучены достаточно хорошо, то биологическая роль данных ферментов, в том числе их участие в различных физиологических и патологических процессах исследованы значительно хуже. Поэтому представляется весьма интересным изучение их активности при различных процессах в организме, в том числе при острой алкогольной интоксикации.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы исследования

Опыты проводили на самках и самцах белых беспородных крыс массой 150-200 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария.
В работе использовали четыре группы животных. У самок крыс определяли стадию эстрального цикла по влагалищному мазку [59], при цитологическом исследовании которого животных разделяли на три группы. Животные первой группы находились в стадии диэструса, второй - в стадии проэструса, третьей - в стадии эструса, четвертую группу составляли самцы. Каждую из четырех групп разбивали на четыре подгруппы: первая - интактная. Животным второй подгруппы внутрибрюшинно вводили 5% раствор этанола, в дозе 1 г на кг веса тела, а животным третьей - 20% раствор этанола в дозе 4 г на кг веса. Животным четвертой подгруппы вводили внутрибрюшинно эквивалентное количество физиологического раствора. Животных декапитировали через 0,5 часа, 4часа и 18 часов после инъекции. Декапитацию самок крыс в стадии проэструса проводили только через 0,5 часа и 4 часа после инъекции, так как продолжительность данной стадии эстрального цикла около 12 часов. Затем извлекали гипофиз, гипоталамус, стриатум, надпочечники и половые железы. Ткани помещали в предварительно охлажденный физиологический раствор, очищали от кровеносных сосудов и оболочек, высушивали фильтровальной бумагой.
Для определения активности ферментов ткани взвешивали, а затем гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 10 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,6), содержащем 50 мМ NaCl в соотношении 1:100 (вес:объем) для отделов мозга, надпочечников и яичников, 1:50 для семенников.
В качестве специфических ингибиторов применяли ФМСФ (“Serva”, США) и ГЭМЯК (любезно предоставлена доктором О.Л. Варламовым). Субстраты дансил-фен-ала-арг, дансил-фен-лей-арг были синтезированы к.х.н. В.Н. Калихевичем. Для внутрибрюшинных инъекций применялся дважды перегнанный медицинский спирт. В работе использовали ацетат натрия (“Merck”, Германия), трис-НСl (“Serva”, США), все остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией ”ХЧ” и ”ОСЧ”.
2.2. Методы исследования
2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М
Активность КПН определяли модифицированным методом Fricker и Snyder [153].
Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольной пробы). Для определения активности КПМ делали также, с той лишь разницей, что в качестве буфера использовали 200 мМ трис-НCl, рН 7,4. Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37?С. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37?С 210 мкМ раствора дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси 42 мкМ). Пробы инкубировали 60 минут при 37?С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl.
Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000об/мин.
Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ-2 при лex=360 нм и лem=530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.
Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка.
2.2.2. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы
Активность ФМСФ-КП определяли флюориметрически [42] с использованием дансил-фен-лей-арг в качестве субстрата.
В контрольные пробы вносили 140 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl, pH 5,6, 50 мкл препарата фермента и 10 мкл 25 мМ ФМСФ, приготовленного на этаноле. ФМСФ вносили в реакционную смесь после внесения препарата фермента. Опытные пробы содержали 150 мкл указанного буфера и 50 мкл препарата фермента. Пробы преинкубировали 8 мин при 37oC, затем вносили 50 мкл предварительно нагретого до 37oC 210 мкМ раствора дансил-фен-лей-арг, приготовленного на воде. Далее пробы обрабатывали как описано для КПH и КПМ. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-лей в хлороформе.
Активность фермента определяли как разницу прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ФМСФ и выражали в нмоль дансил-фен-лей, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Количество белка в пробах определяли по методу Lowry и соавт. [195].
2.2.3. Статистическая обработка результатов исследования
Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [68]. Корреляционный и дисперсионный анализы проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США) в режимах Simple Correlation, One-Way ANOVA и Multifactor ANOVA. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью Multiple range analysis (Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США)). Принадлежность экспериментальных (временных) подгрупп к разным гомогенным группам проводили только в случае достоверности критерия Фишера. При этом оценивали количество гомогенных групп, образуемых экспериментальными подгруппами, с уровнем достоверности р<0,05. Баллы подгруппам присваивали на основании их принадлежности к разным гомогенным группам по мере увеличения среднего. При этом минимальный балл получала временная подгруппа с минимальным средним, максимальный балл - временная подгруппа с максимальным средним, а дробный балл получали подгруппы, входящие одновременно в две гомогенные группы. На основании присвоенных баллов судили о динамике изменения активности ферментов.
2.3. Схема эксперимента

Самки
Самцы
Определение стадии эстрального цикла
Диэструс
Проэструс
Эструс
норма
контроль
этанол
норма
контроль
Этанол
норма
контроль
Этанол
норма
контроль
этанол
1г/кг
4г/кг
1г/кг
4г/кг
1г/кг
4г/кг
1г/кг
4г/кг
Забой животных через 0,5, 4 и 18 часов после воздействия
Определение активности КПН, ФМСФ-КП и КПМ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла
3.1.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла
а) Распределение активности карбоксипептидазы Н
в тканях интактных самок крыс
Результаты исследований показали, что в зависимости от стадии эстрального цикла меняется активность КПН в гипофизе, гипоталамусе, стриатуме и яичниках (табл.1).
Разные стадии эстрального цикла могут быть расположены по мере убывания активности КПН в гипофизе в ряд: проэструс-эструс-диэструс.
Таблица 1. Активность КПН на разных стадиях эстрального цикла в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68).
Отдел
Стадия эстрального цикла
Диэструс
Проэструс
Эструс
Гипофиз
0,445±0,04^^^
1,229±0,143
0,690±0,048<<, ^^
Гипоталамус
0,238±0,019
0,211±0,012
0,247±0,011^
Стриатум
0,153±0,013
0,168±0,015
0,195±0,012<
Надпочечники
0,091±0,012
0,071±0,004
0,067±0,009
Яичники
0,029±0,015^
0,094±0,027
0,042±0,027
Примечание. Здесь и в табл. 5 достоверность отличий критерия Стьюдента по сравнению с диэструсом и проэструсом: < - p<0,05, << - p<0,01 и ^ - p<0,05, ^^ - p<0,01, ^^^ - p<0,001 соответственно.
Известно, что стадия проэструса характеризуется наиболее высоким уровнем секреции эстрогенов созревающими фолликулами яичника, а стадия диэструса низким уровнем эстрогенов в организме [12, 17, 45]. В свою очередь секреция эстрогенов находится под влиянием ФСГ и ЛГ, концентрация которых также возрастает в проэструсе и уменьшается в диэструсе [11, 46]. Эти данные позволяют предположить, что КПН, возможно участвует в регуляции уровня этих гормонов в гипофизе на разных стадиях эстрального цикла.
Активность КПН в гипоталамусе на стадии эструса выше чем на стадии проэструса на 17%. В стриатуме в эструсе активность фермента выше по отношению к диэструсу на 27%. Так как КПН вовлекается в процесс биосинтеза энкефалинов, то, возможно, что такое увеличение активности фермента, приводящее к росту содержания энкефалинов в стриатуме, объясняет существенное снижение добровольного потребления этанола самками крыс в эструсе [19, 45].
В надпочечниках достоверных изменений активности КПН в зависимости от стадии эстрального цикла не выявлено.
В яичниках активность КПН на стадии проэструса достоверно выше, чем в диэструсе, что позволяет предположить возможность вовлечения фермента в циклические изменения уровня биологически активных пептидов в этом органе [18, 240].
Таким образом, вероятно, КПН принадлежит важная роль в регулировании уровня нейрогормонов на разных стадиях эстрального цикла.
б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок
На стадии ДЭ через 4 часа после введения физиологического раствора активность КПН изменялась в гипофизе, гипоталамусе и надпочечниках (рис. 1). При этом в гипофизе она возросла почти в 2 раза, а в гипоталамусе и надпочечниках уменьшилась на 29% и 51% соответственно. Уменьшение активности КПН в гипоталамусе, вероятно, может способствовать увеличению количества выводимой из организма жидкости, за счет уменьшения образования вазопрессина [72]. Через 0,5 и 18 часов после инъекции достоверных изменений активности КПН не обнаружено. В стриатуме и яичниках введение физиологического раствора не влияло на активность КПН.
На стадии проэструса активность КПН в гипофизе через 0,5 и 4 часа после внутрибрюшинного введения физиологического раствора была достоверно ниже на 35% и 53% соответственно по сравнению с интактными самками. В надпочечниках снижение активности КПН отмечено только через 0,5 часа после инъекции физраствора на 34% по сравнению с интактной группой крыс. Вероятно, такие изменения активности фермента связаны с особенностями оказываемого воздействия, при котором в организм поступает дополнительное количество жидкости [38]. В гипоталамусе, стриатуме и яичниках активность КПН достоверно не изменялась при введении физиологического раствора.
На стадии эструса в гипофизе через 0,5 и 4 часа после введения физраствора активность КПН была ниже нормы на 48% и 42% соответственно. В стриатуме через 0,5 часа после инъекции активность КПН была ниже на 25% по сравнению с интактной группой животных. В гипоталамусе, надпочечниках и яичниках активность КПН достоверно не изменялась при введении физиологического раствора.
Сравнение активности КПН на разных стадиях эстрального цикла при введении физиологического раствора показало, что на стадии эструса в гипофизе через 0,5 часа после оказания воздействия активность фермента достоверно ниже по отношению к диэструсу и проэструсу. Через 4 часа после введения физраствора активность уменьшалась при переходе от диэструса к проэструсу и далее к эструсу. В гипофизе через 18 часов после инъекции активность КПН была достоверно выше в диэструсе по сравнению с эструсом.
В гипоталамусе на стадии эструса через 4 часа после внутрибрюшинного введения физиологического раствора активность КПН выше, чем в диэструсе и проэструсе, а через 18 часов в диэструсе ниже, чем в эструсе.
В стриатуме на стадии диэструса через 0,5 часа после инъекции 0,9 % раствора NaCl активность фермента была выше, чем в проэструсе. Через 4 часа после оказанного воздействия в стриатуме активность КПН в эструсе достоверно выше по отношению к диэструсу и проэструсу, через 18 часов активность фермента в эструсе продолжала оставаться на более высоком уровне, чем в диэструсе.
В надпочечниках на стадии диэструса активность КПН через 0,5 часа после введения физиологического раствора достоверно выше, чем в эструсе и проэструсе, а через 4 часа соотношение активностей фермента на этих стадиях меняется на обратное.
В яичниках на стадии проэструса активность КПН достоверно выше, чем на стадии эструса. Через 4 и 18 часов в диэструсе активность ниже по сравнению с эструсом. Таким образом, введение физраствора приводит к изменению соотношения активности фермента в исследуемых отделах в ходе эстрального цикла и ведет в свою очередь к изменению соотношения нейропептидов, что, вероятно отражает один из механизмов нарушения функционирования половой системы при стрессе.
Введение физраствора не оказывало влияния на активность КПН через 0,5 часа после воздействия на стадии диэструса и через 18 часов на стадиях диэструса и эструса. Активность КПН в яичниках не зависела от инъекции физраствора. Наиболее существенные изменения после введения физраствора в активности фермента наблюдались в гипофизе и менее существенные в гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках, причем во всех этих отделах, за исключением активности фермента в гипофизе через 4 часа после введения изотонического раствора NaCl, активность фермента была ниже, чем у интактных животных. Кроме того, активность КПН при внутрибрюшинном введении физиологического раствора во всех изученных отделах зависела от стадии эстрального цикла. Все это приводит к тому, что после инъекции физраствора соотношение активностей фермента в зависимости от стадии эстрального цикла во всех органах отличается от нормы.
в) Исследование активности карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс
На стадии диэструса в гипофизе через 4 часа после введения этанола в дозе 1 г на кг веса наблюдалось снижение активности КПН на 33% по сравнению с контрольной группой животных. В гипоталамусе, надпочечниках и яичниках через тот же промежуток времени активность фермента была выше, чем у контрольной группы животных на 33%, 47% и 112% соответственно. В гипоталамусе через 0,5 часа после инъекции раствора этанола активность КПН была выше на 37% по сравнению с контрольными самками (рис.1). Наши данные согласуются со сведениями об усилении образования и секреции энкефалинов, АКТГ, в-эндорфина при острой алкогольной интоксикации [94, 158, 241], в биосинтезе которых принимает участие КПН [27, 28, 29].
Этанол в дозе 4 г/кг в диэструсе измененял активность фермента в гипофизе: через 0,5 и 18 часов она была выше контрольных значений на 43% и 140% соответственно, а через 4 часа - ниже на 57%. В гипоталамусе через 0,5 и 4 часа после введения этанола активность КПН была выше на 26% и 38% соответственно, а через 18 часов - ниже на 31% по сравнению с контрольной группой животных. Снижение активности фермента, возможно, направлено на нормализацию пептидэргических систем. В яичниках только через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 4г/кг активность фермента была выше таковой по сравнению с контролем в 3,6 раза. Увеличение активности КПН при острой алкогольной интоксикации согласуется с представлением об активации многих пептидэргических систем при острой алкогольной интоксикации [19, 86].
Интересно отметить, что в стриатуме на стадии диэструса этанол не оказывал влияния на активность КПН, что, вероятно, может объясняться особенностями биохимического и физиологического статуса животных на разных стадиях эстрального цикла [17, 45, 247].
Достоверные отличия в активности КПН в стадии диэструса при введении различных доз этанола обнаружены в гипофизе и гипоталамусе через 18 часов, а также в яичниках через 0,5 часа после инъекции. При этом этанол в дозе 1г/кг не вызывал изменений в активности фермента, однако при введении этанола в дозе 4 г/кг активность КПН возрастала в 2 раза в гипофизе, в 2,8 раза в яичниках и уменьшалась в гипоталамусе на 23%.
Таким образом, введение этилового спирта на стадии диэструса вызывает разнонаправленные изменения активности КПН. Кроме того, через 18 часов после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность фермента оставалась на прежнем уровне во всех рассмотренных отделах.
Для более полного понимания характера выявленных изменений активности фермента первичный экспериментальный материал был подвергнут дисперсионному анализу влияния времени после инъекции при введении различных доз этанола (табл.2).
Дисперсионный анализ показал отсутствие влияния времени на активность КПН при введении физиологического раствора и этанола в дозе 1г/кг в диэструсе. Однако при инъекции этанола в дозе 4 г/кг наблюдается достоверная зависимость активности КПН от времени в гипофизе и гипоталамусе. При этом этанол в дозе 4г/кг вызывал в гипофизе U-образное изменение активности фермента, а в гипоталамусе активность фермента плавно снижалась с течением времени.
Таблица 2. Дисперсионный анализ влияние времени на активность карбоксипептидазы Н в диэструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).
Отдел
Воздействие
Fф
Норма
Временные подгруппы
0,5 ч.
4 ч.
18 ч.
Гипофиз
Физраствор
3,45*
1
1
1
1
Этанол 1г/кг
2,87
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
7,03**
1,5
2,5
1
3
Гипоталамус
Физраствор
2,57
-
-
-
-
Этанол 1г/кг
2,09
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
4,03*
1,5
2
1,5
1
Стриатум
Физраствор
0,90
-
-
-
-
Этанол 1г/кг
0,93
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
1,05
-
-
-
-
Надпочечники
Физраствор
0,56
-
-
-
-
Этанол 1г/кг
0,52
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
0,26
-
-
-
-
Яичники
Физраствор
0,62
-
-
-
-
Этанол 1г/кг
0,33
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
2,79
-
-
-
-
Примечание. Здесь и в табл.3-4, 6-8, 10-12, 14, 16, 18, 19 показана достоверность критерия Фишера: * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001; прочерк - определение не проводилось.
На стадии проэструса активность КПН при введении этилового спирта (доза 1г на кг массы тела) в гипофизе через все исследованные промежутки времени была ниже контрольных значений: на 45% через 0,5 часа и на 24% через 4 часа. В других отделах этанол в дозе 1г/кг не изменял активность КПН относительно контроля.
В дозе 4г/кг в проэструсе этанол вызывал снижение активности в гипофизе через 0,5 часа и в надпочечниках через 4 часа на 32% и 48% соответственно по сравнению с контрольной группой крыс. В яичниках через
4 часа после инъекции этанола активность фермента составляла 174% по отношению к контрольной группе.
На стадии проэструса достоверное влияние различных доз этанола обнаружено в надпочечниках и яичниках через 4 часа после оказанного воздействия: этанол в дозе 1 г/кг не изменял активность КПН по сравнению с контролем, однако в дозе 4 г/кг в надпочечниках уменьшал, а в яичниках увеличивал активность фермента.
Следует отметить, что в проэструсе введение этанола в дозе 1 г/кг и 4 г/кг не влияло на активность КПН в гипоталамусе и стриатуме через все исследованные промежутки времени.
Согласно результатам дисперсионного анализа активность КПН в проэструсе не зависела от времени. Однако в гипофизе инъекция физраствора или этанола приводила к снижению активности фермента через 0,5 и 4 часа по сравнению с нормой (табл.3).
В стадии эструса этанол в дозе 1 г/кг через 0,5 часа после инъекции увеличивал активность КПН во всех исследованных органах, кроме яичников: в гипофизе на 162%, в гипоталамусе на 39%, в стриатуме на 29% и в надпочечниках на 106% по сравнению с контрольной группой животных. В гипофизе активность КПН повышалась и через другие исследованные промежутки времени: через 4 и 18 часов на 92% и 30% соответственно по отношению к контролю. В то же время в стриатуме через 4 часа после внутрибрюшинного введения этилового спирта в дозе 1 г/кг активность фермента относительно контрольной группы уменьшилась на 19%. В надпочечниках через 18 часов после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность КПН была выше на 44%, чем в контрольной группе животных.
На стадии эструса через 0,5 и 18 часов после введении этанола в дозе 4 г/кг ни в одном органе активность фермента не отличалась от контрольных
Таблица 3. Дисперсионный анализ влияние времени на активность карбоксипептидазы Н в проэструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).
Отдел
Воздействие
Fф
Норма
Временные подгруппы
0,5 ч.
4 ч.
Гипофиз
Физраствор
10,88***
2
1
1
Этанол 1г/кг
17,14***
2
1
1
Этанол 4 г/кг
12,71***
2
1
1
Гипоталамус
Физраствор
1,12
-
-
-
Этанол 1г/кг
0,36
-
-
-
Этанол 4 г/кг
1,07
-
-
-
Стриатум
Физраствор
1,10
-
-
-
Этанол 1г/кг
0,12
-
-
-
Этанол 4 г/кг
0,97
-
-
-
Надпочечники
Физраствор
3,80*
1
1
1
Этанол 1г/кг
0,94
-
-
-
Этанол 4 г/кг
3,63
-
-
-
Яичники
Физраствор
1,55
-
-
-
Этанол 1г/кг
2,71
-
-
-
Этанол 4 г/кг
1,66
-
-
-
величин, кроме яичников, где через 18 часов после воздействия активность КПН уменьшилась в 2,6 раза. В гипоталамусе и стриатуме через 4 часа после воздействия этанола в дозе 4 г/кг активность фермента была ниже на 24% и 52% соответственно по отношению к контрольным самкам.
Статистически значимые отличия во влиянии разных доз этанола на активность КПН на стадии эструса обнаружены в гипофизе через 0,5 часа, в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме через 4 часа, а также в надпочечниках и яичниках через 18 часов после внутрибрюшинной инъекции алкоголя. При этом этанол в дозе 1 г/кг повышал активность КПН в гипофизе и надпочечниках, но не влиял на активность в дозе 4 г/кг по сравнению с контролем. В гипоталамусе и яичниках меньшая доза алкоголя не вызывала изменений, а большая приводила к снижению активности КПН. В стриатуме при введении этанола в дозе 4 г/кг активность фермента была ниже, чем при введении этанола в дозе 1 г/кг по сравнению с контрольной группой животных. Различия во влиянии двух доз этанола, возможно, связаны со спецификой действия больших и малых доз этанола [19].
Активность КПН в эструсе зависела от времени при введении физиологического раствора в гипофизе и гипоталамусе, а при введении этанола в дозе 1г/кг - в гипоталамусе и надпочечниках и при инъекции этанола в дозе 4 г/кг, как и в случае с физраствором - в гипофизе и гипоталамусе (табл.4).
При этом в контрольной группе животных активность фермента в гипофизе через 0,5 и 4 часа была выше по сравнению с нормой, а через 18 часов возвращалась к исходному уровню. В то же время при введении этанола в дозе 1 г/кг зависимость от времени после инъекции не наблюдалась и активность КПН достоверно не отличалась от нормы. При введении этанола в дозе 4 г/кг активность фермента имела тенденцию к снижению к 4 часам, к 18 часам наблюдалось повышение активности фермента.
В гипоталамусе на стадии эструса введение физиологического раствора приводило к постепенному увеличению активности КПН при переходе от 0,5 часа к 18 часам, при введении этанола в дозе 4 г/кг через 0,5 часа наблюдалось повышение активности фермента, к 4 часам активность понижалась и возвращалась к уровню, характерному для интактных крыс через 18 часов, сходная тенденция наблюдалась и при введении этанола в дозе 1 г/кг.
В надпочечниках влияние времени на активность КПН наблюдается только при введении этанола в дозе 1 г/кг.
Таблица 4. Дисперсионный анализ влияние времени на активность карбоксипептидазы Н в эструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).
Отдел
Воздействие
Fф
Норма
Временные подгруппы
0,5 ч.
4 ч.
18 ч.
Гипофиз
Физраствор
12,47***
2
1
1
2
Этанол 1г/кг
2,58
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
7,17**
2,5
1,5
1
3
Гипоталамус
Физраствор
3,67***
1,5
1
1,5
2
Этанол 1г/кг
6,16**
1
2
1
1,5
Этанол 4 г/кг
3,92*
1,5
2
1
1,5
Стриатум
Физраствор
3,26*
1
1
1
1
Этанол 1г/кг
0,93
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
3,03
-
-
-
-
Надпочечники
Физраствор
3,01
-
-
-
-
Этанол 1г/кг
7,95**
1
1,5
1
2
Этанол 4 г/кг
0,60
-
-
-
-
Яичники
Физраствор
1,07
-
-
-
-
Этанол 1г/кг
0,42
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
1,61
-
-
-
-
При сравнении активности КПН на различных стадиях эстрального цикла при внутрибрюшинном введении этанола было обнаружено, что активность фермента в гипофизе через 0,5 часа и гипоталамусе через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1г/кг достоверно выше в эструсе, по сравнению с диэструсом и проэструсом, кроме того, в диэструсе она выше, чем в проэструсе. В гипоталамусе через 0,5 часа и гипофизе через 4 часа активность фермента на стадии эструса и диэструса достоверно выше, чем в проэструсе, а в надпочечниках через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг выше в эструсе по отношению к проэструсу. В стриатуме и яичниках активность фермента при введении этанола в дозе 1 г/кг не изменялась в зависимости от стадии эстрального цикла. В гипофизе и гипоталамусе через 18 часов после введении этанола в количестве 1 г/кг активность КПН была выше в эструсе, чем в диэструсе.
Через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг активность в гипофизе и яичниках на стадии диэструса была достоверно выше, чем в эструсе и проэструсе, но не отличалась достоверно между последними двумя стадиями, а через 4 часа в этих отделах высокая активность КПН была на стадиии проэструса и низкая в эструсе и диэструсе. При внутрибрюшинном введении этанола в дозе 4 г/кг в надпочечниках активность КПН в диэструсе и эструсе была выше, чем в проэструсе. В гипоталамусе через 18 часов после воздействия этанола в дозе 4 г/кг активнсть КПН в эструсе была достоверно больше по сравнению с диэструсом.
Таким образом, острая алкогольная интоксикация приводит к существеннному изменению активности КПН в тканях самок, причем в большинстве случаев активность фермента увеличивалась, что согласуется с данными, полученными другими исследователями на самцах [14, 25, 26]. Наиболее существенные изменения претерпевала активность фермента в гипофизе и яичниках. В ряде случаев активность КПН зависела от дозы вводимого этанола, причем инъекции этанола в дозе 1 г/кг и 4 г/кг могут оказывать как сходное, так и разнонаправленное влияние на активность фермента в исследуемых отделах. Зависимость активности КПН от времени обнаруживается в гипофизе на всех стадиях эстрального цикла, в гипоталамусе на стадии диэструса и эструса, а на последней стадии и в надпочечниках, но только при введении физраствора. При инъекциях этанола наблюдалась зависимость активности КПН от стадии эстрального цикла во всех исследованных отделах, причем, как правило, активность фермента на стадии диэструса и эструса выше, чем в проэструсе. Таким образом, внутрибрюшинное введение этанола приводит к изменению активности КПН на разных стадиях эстрального цикла по сравнению с интактной и контрольной группами животных, что, возможно, является одним из патогенетических факторов алкоголизма и, вероятно, может приводить к нарушению нормального созревания фолликулов яичника, к неадекватному протеканию фаз полового цикла, ановуляции [2, 73].
3.1.2. Изучение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла
а) Распределение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях интактных самок крыс
В ходе проведения эксперимента достоверное изменение активности ФМСФ-КП обнаружено только в яичниках. В этом органе активность фермента на стадии проэструса и эструса была в 1,7 и 1,9 раза соответственно выше по сравнению с диэструсом (табл.5).
Наличие зависимости активности ФМСФ-КП от стадии эстрального цикла в яичниках позволяет предположить, что, вероятно, она, наряду с КПН, может вовлекаться в циклические изменения уровня биологически активных пептидов в этом органе, а также в процессы развития фолликула и желтого тела.
Таблица 5. Активность ФМСФ-КП на разных стадиях эстрального цикла в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68).
Отдел
Стадия эстрального цикла
Диэструс
Проэструс
Эструс
Гипофиз
0,647±0,087
0,529±0,031
0,624±0,064
Гипоталамус
0,218±0,026
0,200±0,030
0,216±0,016
Стриатум
0,170±0,024
0,199±0,011
0,218±0,028
Надпочечники
0,810±0,091
1,005±0,079
1,069±0,188
Яичники
0,258±0,035^^
0,436±0,034
0,481±0,046<<
б) Активность ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок
На стадии диэструса в гипофизе через 4 после введения физраствора активность ФМСФ-КП уменьшалась на 46% по сравнению с интактными животными. В стриатуме через 0,5 часа после воздействия активность фермента была выше на 31%, чем в норме. В надпочечниках через 0,5 и 18 часов после введения физиологического раствора наблюдалось повышение активности фермента на 70% и 50% соответственно. В яичниках через все исследуемые интервалы времени активность ФМСФ-КП была увеличена: через 0,5 часа в 2,9 раза, через 4 часа в 4,1 раза, через 18 часов в 8,5 раз по сравнению с интактными самками. В гипоталамусе отличий от нормы после введения физраствора не обнаружено (рис. 2).
На стадии проэструса в гипофизе, гипоталамусе и надпочечниках инъекция изотонического раствора NaCl не изменяла активность ФМСФ-КП. В стриатуме через 0,5 и 4 часа отмечено снижение активности ФМСФ-КП на 24% и 28% соответственно, а в яичниках увеличение активности фермента через те же промежутки времени в 4,2 и 3 раза соответственно по отношению к интактным крысам.
На стадии эструса в гипофизе активность ФМСФ-КП после введения физиологического раствора уменьшалась через 0,5 и 18 часов на 32% и 45% соответственно по сравнению с нормой. В гипоталамусе и стриатуме снижение активности происходило только через 18 часов после инъекции физраствора на 25% и 33% соответственно. В яичниках через 0,5 часа после введения физиологического раствора активность ФМСФ-КП не отличалась от нормы, через 4 часа была выше на 339%, а через 18 часов ниже на 35% по сравнению с нормой. В надпочечниках введение физиологического раствора не влияло на активность ФМСФ-КП.
Сравнение активности ФМСФ-КП на разных стадиях эстрального цикла при введении физиологического раствора выявило, что в гипофизе через 4 часа после инъекции активность фермента на стадии эструса достоверно выше, чем в диэструсе, через 18 часов после воздействия соотношение активностей ФМСФ-КП на этих стадиях меняется на противоположное.
В гипоталамусе и надпочечниках через 0,5 часа после внутрибрюшинного введения физиологического раствора активность в фермента в эструсе и проэструсе ниже, чем в диэструсе; через 4 часа наблюдается более высокая активность в эструсе по сравнению с проэструсом, а через 18 часов на стадии эструса она ниже, чем в диэструсе.
В стриатуме через 0,5 часа в эструсе и диэструсе активность ФМСФ-КП была более высокой, чем в проэструсе. Через 4 часа после внутрибрюшинной инъекции активность фермента уменьшалась в ряду: эструс-диэструс-проэструс. В надпочечниках через 4 часа после введения изотонического раствора NaCl активность ФМСФ-КП в эструсе была выше по сравнению с диэструсом и проэструсом. В яичниках через 0,5 после инъекции физраствора наиболее высокая активность фермента наблюдалась в проэструсе, самая низкая - в эструсе и была промежуточной по своему значению в диэструсе, через 4 часа в эструсе фермент был более активен, чем в проэструсе, где в свою очередь активность фермента была выше, чем в диэструсе. Через 18 часов после внутрибрюшинного введения физиологического раствора в яичниках активность ФМСФ-КП в эструсе была ниже по сравнению с диэструсом.
Таким образом, инъекция физраствора вызывает изменение активности ФМСФ-КП во всех исследуемых отделах и приводит к появлению зависимости активности фермента от стадии эстрального цикла в гипофизе, гипоталамусе, стриатуме, надпочечниках, чего не наблюдалось у интактных крыс, что, по-видимомому, приводит к изменению соотношения различных нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла и приводит к нарушению овуляции и другим аномалиям в функционировании половой системы [2, 73].
в) Исследование активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс
В диэструсе при введении этанола в дозе 1 г/кг активность фермента возрастала в гипофизе и яичниках через 0,5 часа на 55% и 252%, через 4 часа на 116% и 89% соответственно, но не отличалась от контроля через 18 часов. В других исследованных органах активность ФМСФ-КП возрастала только через 4 часа после инъекции этилового спирта в дозе 1г/кг: в гипоталамусе на 36%, в стриатуме на 26% и в надпочечниках на 55% по сравнению с контрольной группой животных (рис.2).
На стадии диэструса при введении этанола в дозе 4 г/кг через 4 часа активность ФМСФ-КП была выше, чем в контроле в гипофизе на 128%, в гипоталамусе на 46%. Через 18 часов после введения этанола в дозе 4 г/кг активность фермента снижалась в гипофизе на 50%, в гипоталамусе на 38% по отношению к контрольным самкам. В яичниках наблюдается постепенное снижение активности ФМСФ-КП во времени: через 0,5 часа активность фермента выше контрольных значений в 4,4 раза, через 4 часа в 1,5 раза, а через 18 часов ниже контроля в 9,5 раз.
Стоит отметить, что введение этанола в дозе 4 г/кг в диэструсе не приводило к изменению активности ФМСФ-КП в стриатуме и надпочечниках через все исследованные промежутки времени.
Таким образом, на стадии диэструса наиболее существенные изменения в активности фермента наблюдались в яичниках.
Достоверные различия во влиянии разных доз спирта на активность ФМСФ-КП обнаружены в гипофизе через 0,5 часа, в стриатуме через 0,5 и 4 часа, в гипоталамусе и яичниках через 18 часов после инъекции. При этом этанол в дозе 1 г/кг в гипофизе и стриатуме через 4 часа активировал ФМСФ-КП, но не изменял активность фермента при введении этанола в дозе 4 г/кг по сравнению с контрольными животными. В стриатуме большая доза этанола через 0,5 часа после воздействия сильнее активировала фермент, чем меньшая. В гипоталамусе при внутрибрюшинном введении этанола в дозе 1 г/кг не было обнаружено изменения активности, однако при увеличении дозировки этилового спирта наблюдалось уменьшение активности ФМСФ-КП по отношению к контрольным самкам. После введения этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП в яичниках не отличалась от контроля, но была в 7,8 раза выше по сравнению с активностью фермента при введении этанола в дозе 4 г/кг.
Таким образом, на стадии диэструса этанол в дозе 1 г/кг повышал или не оказывал влияния на активность фермента, а в дозе 4г/кг оказывал разнонаправленное воздействие.
Результаты дисперсионного анализа влияния времени на активность ФМСФ-КП в диэструсе выявили, что активность зависела от времени при введении физиологического раствора и этанола в дозе 4г/кг в гипофизе и гипоталамусе (табл.6). В стриатуме влияния времени на активность фермента не обнаружено. В надпочечниках зависимость от времени после введения растворов этилового спирта и хлорида натрия оказалась сходной: при введении физраствора активность увеличивалась к 0,5 часа, несколько снижалась к 4 часам и в интервале 4 -18 часов достоверно не изменялась, в случае введения этанола снижение наблюдалось при переходе к 18 часам. В яичниках введение физраствора вызывало постепенное увеличение активности ФМСФ-КП; через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность фермента увеличичалась и оставалась на этом уровне вплоть до 18 часов. Введение этанола в дозе 4 г/кг приводило к тому, что активность фермента в яичниках резко увеличивалась через 0,5 часа, а затем постепенно снижалась, достигая к 18 часам исходного уровня В проэструсе этанол в дозе 1 г/кг не вызывал изменений в активности ФМСФ-КП в гипофизе и яичниках.
Таблица 6. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП в диэструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).
Отдел
Воздействие
Fф
Норма
Временные подгруппы
0,5 ч.
4 ч.
18 ч.
Гипофиз
Физраствор
4,43*
1,5
1,5
1
2
Этанол 1г/кг
0,69
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
3,40*
1,5
1,5
2
1
Гипоталамус
Физраствор
4,74*
1,5
2
1
1,5
Этанол 1г/кг
1,38
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
4,65*
1,5
2
2
1
Стриатум
Физраствор
1,54
-
-
-
-
Этанол 1г/кг
2,39
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
2,71
-
-
-
-
Надпочечники
Физраствор
4,49*
1
2
1,5
1,5
Этанол 1г/кг
6,19**
1
2
2
1,5
Этанол 4 г/кг
6,14**
1
2
2
1,5
Яичники
Физраствор
22,24***
1
1,5
2
3
Этанол 1г/кг
16,74***
1
2
2
2
Этанол 4 г/кг
63,60***
1
3
2
1
В гипоталамусе и стриатуме через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность фермента была на 24% и 36% выше, если доза этанола составляла 4 г/кг, то активность фермента была на 52% и 61% соответственно выше по сравнению с контрольной группой животных.
На стадии проэструса в надпочечниках через 0,5 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента была на 25%, а через 4 часа на 19% выше, чем в контроле. Повышение активности ФМСФ-КП согласуется с данными об увеличении синтеза и секреции энкефалинов, в-эндорфина, АКТГ, пролактина при острой алкгольной интоксикации [94, 158, 241] и позволяет предположит причастность этого фермента к процессингу регуляторных пептидов.
Этанол в дозе 4 г/кг снижал активность фермента относительно контрольной группы в гипофизе, надпочечниках и яичниках через 0,5 часа в 2,2, 1,9 и 5,5 раз соответственно. В гипоталамусе, стриатуме и яичниках при введении этанола в дозе 4 г/кг через 4 часа наблюдалась активация ФМСФ-КП на 52%, 61% и 63% соответственно по отношению к контрольной группе.
Таким образом, на стадии проэструса при введении этанола в дозе 1 г/кг наиболее существенные изменения в активности ФМСФ-КП происходили в стриатуме, а при введении этанола в дозе 4 г/кг - в яичниках. Кроме того, этанол в большей дозе вызывал более значимые сдвиги в активности фермента, что согласуется с мембранотропным эффектом этанола, сила которого увеличивается с ростом концентрации алкоголя [10,19, 88].
В проэструсе обнаружено достоверное отличие в действии, которое оказывают разные дозы алкоголя: в гипоталамусе через 4 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг ФМСФ-КП активируется сильнее, чем при инъекции этанола в дозе 1 г/кг. Кроме того, в яичниках через 0,5 часа под влиянием этанола в дозе 4 г/кг активность фермента уменьшалась, а при внутрибрюшинной инъекции этанола в дозе 1 г/кг не отличалась от контрольных значений; через 4 часа после воздействия этанола в дозе 4 г/кг наблюдалось увеличение активности фермента, а при внутрибрюшинном введении этанола в дозе 1 г/кг отличий от контроля зафиксировано не было.
Согласно результатам дисперсионного анализа в проэструсе зависимость активности ФМСФ-КП от времени после воздействия в гипофизе и надпочечниках наблюдается только при введении этанола в дозе 4 г/кг (табл. 7). В гипоталамусе на стадии проэструса активность фермента не зависела от времени. В стриатуме зависимость обнаружена только при введении физиологическго раствора (активность ФМСФ-КП с течением времени уменьшается), тогда как в яичниках активность фермента
Таблица 7. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП в проэструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).
Отдел
Воздействие
Fф
Норма
Временные подгруппы
0,5 ч.
4 ч.
Гипофиз
Физраствор
1,41
-
-
-
Этанол 1г/кг
3,18
-
-
-
Этанол 4 г/кг
6,03*
2
1
1,5
Гипоталамус
Физраствор
1,19
-
-
-
Этанол 1г/кг
0,25
-
-
-
Этанол 4 г/кг
1,06
-
-
-
Стриатум
Физраствор
5,40*
2
1,5
1
Этанол 1г/кг
0,15
-
-
-
Этанол 4 г/кг
0,93
-
-
-
Надпочечники
Физраствор
1,21
-
-
-
Этанол 1г/кг
1,23
-
-
-
Этанол 4 г/кг
9,05**
2
1
2
Яичники
Физраствор
28,41***
1
2
2
Этанол 1г/кг
7,73
1
2
1,5
Этанол 4 г/кг
41,96***
1
1
2
изменялась с течением времени при введении как физраствора, так и растворов этилового спирта.
На стадии эструса после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП в гипофизе была выше, чем в контрольной группе животных через 0,5 и 4 часа на 61%, а через 18 часов на 133%. Через 0,5 и 18 часов после введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента больше, чем в контроле: в надпочечниках на 47% и 78%, а в яичниках в 5,2 и 5,1 раза соответственно. В гипоталамусе активность ФМСФ-КП возрастает через 4 и 18 часов после инъекции алкоголя в дозе 1 г/кг на 35% и 68% соответственно.
В эструсе введение этанола в дозе 4 г/кг не изменяло активность ФМСФ-КП в гипофизе через 0,5 часа после инъекции, уменьшало активность фермента через 4 часа на 25% и повышало через 18 часов на 124% по отношению к контрольной группе животных. В гипоталамусе под действием той же дозы этанола активность фермента увеличивалась только через 18 часов после оказанного воздействия на 82%. В стриатуме и надпочечниках активность ФМСФ-КП имела U-образную зависимость от времени после введения этанола (доза 4 г на кг): повышение активности через 0,5 часа на 66% и 25% и через 18 часов на 82% и 58% и снижение активности через 4 часа на 46% и 28% соответственно по отношению к контрольным крысам. В яичниках через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг активность ФМСФ-КП снижалась на 36%, через 4 часа не было достоверных отличий, а через 18 часов - повышение активности в 5,8 раза по сравнению с контролем.
Таким образом, на стадии эструса при введении этанола наиболее существенные изменения в активности ФМСФ-КП происходили в гипофизе и яичниках.
Обнаружены статистически значимые различия во влиянии различных доз этанола. Так в гипофизе алкоголь в дозе 1 г/кг через 0,5 и 4 часа после инъекции повышал активность ФМСФ-КП, а в дозе 4 г/кг, напротив, понижал по сравнению с контрольной группой животных. В гипоталамусе через 4 часа после внутрибрюшинного введения этанола меньшая доза вызывала активацию фермента в отличие от большей, под действием которой активность по отношению к контролю не менялась. В стриатуме и надпочечниках две дозы этанола также оказывали разное влияние: при введении этанола в дозе 1 г/кг через 4 часа не было изменений в активности ФМСФ-КП, в то время как его инъекция в дозе 4 г/кг вызывала снижение активности фермента.
Таким образом, в эструсе, также как и на стадии диэструса, введение этанола в меньшей дозе либо не вызывало изменений в активности ФМСФ-КП, либо приводило к ее увеличению, в то время как инъекция большей дозы могла приводить и к снижению активности фермента.
Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции при введении физраствора и различных доз этанола на стадии эструса показал, что в гипофизе и стриатуме зависимость от времени обнаруживалась при инъекции физиологического раствора и этанола в дозе 4 г/кг, однако активность ФМСФ-КП не зависела от времени после введения этанола в дозе 1 г/кг (табл.8).
Таблица 8. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП в эструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).
Отдел
Воздействие
Fф
Норма
Временные подгруппы
0,5 ч.
4 ч.
18 ч.
Гипофиз
Физраствор
3,72*
2
1,5
1,5
1
Этанол 1г/кг
1,23
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
6,86**
1,5
1
1
2
Гипоталамус
Физраствор
1,49
-
-
-
-
Этанол 1г/кг
3,80*
1
1,5
1,5
2
Этанол 4 г/кг
3,14
-
-
-
-
Стриатум
Физраствор
4,43*
1,5
1,5
2
1
Этанол 1г/кг
0,37
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
4,83*
1,5
2
1
1,5
Надпочечники
Физраствор
2,59
-
-
-
-
Этанол 1г/кг
1,89
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
1,21
-
-
-
-
Яичники
Физраствор
21,20***
1
1
2
1
Этанол 1г/кг
44,49***
1
3
3
2
Этанол 4 г/кг
31,85***
1
1
2
2
В гипоталамусе зависимость от времени наблюдалась только при введении этанола в дозе 4 г/кг, а в надпочечниках ее не выявили. В яичниках на стадии эструса при введении физраствора активность возрастала при переходе от 0,5 часа к 4 часам, а к 18 часам снижалась до исходного уровня. При введении этанола в дозе 1 г/кг активность фермента резко возрастала к 0,5 часа, оставалась на высоком уровне вплоть до 4 часов и несколько снижалась к 18 часам, но все же оставалась выше исходной
Следует отметить, что активность ФМСФ-КП при введении растворов этанола сильно изменялась в зависимости от стадии эстрального цикла, таким образом, ответная реакция на острую алкогольную интоксикацию, вероятно, определяется стадией эстрального цикла.
Так в гипофизе, яичниках (доза 1 г на кг) и надпочечниках (доза 4 г на кг) через 0,5 часа после инъекции этанола самая высокая активность ФМСФ-КП была в диэструсе, самая низкая в проэструсе и промежуточной по своему значению в эструсе. В гипофизе через 4 часа, в гипоталамусе через 0,5 часа, а в стриатуме и надпочечниках через оба этих промежутка времени после введения этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП была достоверно выше в диэструсе и эструсе по отношению к проэструсу. Через 18 часов после инъекции этанола в дозе 1г/кг в гипофизе активность фермента на преовуляторной стадии цикла была более высокой, чем после овуляции, а через 0,5 и 4 часа после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 4 г/кг активность ФМСФ-КП в диэструсе была выше, чем на других стадиях.
В гипоталамусе через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП была достоверно выше в эструсе, чем в проэструсе и диэструсе. В том же отделе головного мозга через 18 часов после введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента в эструсе больше, чем в диэструсе. При введении этанола в дозе 4 г/кг через 0,5 часа активность ФМСФ-КП была достоверно выше в эструсе по сравнению с проэструсом. В гипоталамусе, надпочечниках и яичниках после инъекции этанола (доза 4 г/кг) через 18 часов, а в последнем органе и через 4 часа в эструсе фермент был более активен, чем в диэструсе. В надпочечниках через 4 часа и в яичниках через 0,5 часа после введения этанола в дозе 4 г/кг активность фермента в проэструсе и эструсе была ниже по сравненению с диэструсом.
Интересно отметить, что если в норме достоверные изменения активности ФМСФ-КП в зависимости от стадии эстрального цикла были обнаружены только в яичниках, то при введении физраствора или этанола такая зависимость появлялась во всех исследованных органах. Причем, как правило, в диэструсе и эструсе активность фермента была выше, чем в проэструсе. Разнонаправленные изменения активности ФМСФ-КП, наблюдаемые на разных стадиях эстрального цикла, возможно, свидетельствуют о различном уровне алкогольной мотивации крыс на разных этапах полового цикла.
Итак, при введении этанола наиболее значительные изменения в активности ФМСФ-КП были обнаружены в гипофизе и яичниках, тем самым подтверждает тезис о том, что первое место в реестре эндокринопатий при острой алкогольной интоксикации занимает поражение гипофизарно-гонадальной системы.
На стадии диэструса активность фермента зависела от дозы вводимого этанола во всех отделах, кроме надпочечников, в эструсе такая зависимость не обнаруживалась только в яичниках, а в проэструсе была выявлена в гипоталамусе и яичниках. Зависимость активности ФМСФ-КП от времени в гипофизе при введении физраствора обнаруживалась на всех стадиях эстрального цикла, а при введении этанола (доза 4 г на кг) - только в эструсе, в яичниках активность фермента изменялась с течением времени, как при инъекции физраствора, так и этилового спирта. В гипоталамусе зависимость активности ФМСФ-КП от времени выявлена в диэструсе при введении физраствора, и в эструсе при введении этанола в дозе 4 г/кг, в стриатуме активность фермента зависела от времени только в эструсе после инъекции раствора хлорида натрия и этанола (доза 4 г на кг). В надпочечниках подобная зависимость выявлена в диэструсе после инъекции как физраствора, так и этилового спирта и в проэструсе при введении физиологического раствора.
Таким образом, внутрибрюшинное введение этанола приводит к изменению активности ФМСФ-КП, причем характер этих изменений определяется отделом, в котором исследуется активность ФМСФ-КП, стадией эстрального цикла, дозой вводимого этанола и временем, через которое проводится определение активности фермента.
3.1.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла
а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самок крыс
В гипофизе, надпочечниках и гонадах активность фермента была ниже чувствительности метода определения, поэтому в случае карбоксипептидазы M исследование проводили только в гипоталамусе и стриатуме. В гипоталамусе и стриатуме не обнаружено зависимости активности КПМ от стадии эстрального цикла (табл. 9). Возможно, что в этих отделах КПМ участвует в регуляции базального уровня биологически активных пептидов в ходе полового цикла, но, вероятно, не влияет на циклические изменения их уровня.
Таблица 9. Активность КПМ на разных стадиях эстрального цикла в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68).
Отдел
Стадия эстрального цикла
Диэструс
Проэструс
Эструс
Гипоталамус
0,114±0,013
0,095±0,006
0,114±0,004
Стриатум
0,051±0,005
0,065±0,007
0,066±0,011
б) Активность карбоксипептидазы М в тканях самок крыс при внутрибрюшинном введении физиологического раствора
На стадии диэструса введение физиологического раствора не оказывало влияния на активность КПМ в гипоталамусе. Однако в стриатуме через 0,5 часа после инъекции физраствора активность КПМ возрастала на 88%, а через 4 часа снижалась на 45% по сравнению с интактными животными (рис.3).
На стадии проэструса в гипоталамусе через 4 часа и в стриатуме через 0,5 часа после введения изотонического раствора NaCl активность КПМ была ниже на 25% и 49% соответсвенно, чем в норме.
В гипоталамусе на стадии эструса активность фермента через 4 часа после введения физраствора снижалась на 24% по отношению к интактной группе животных. В стриатуме активность КПМ не менялась при введении физиологического раствора.
Таким образом, наиболее существенное влияние ввведение физраствора оказывало на активность КПМ в стриатуме в диэструсе и проэструсе. Через 18 часов после инъекции физиологического раствора активность фермента достоверно не изменялась ни в гипоталамусе, ни в стриатуме.
При изучении зависимости активности КПМ от разных стадий эстрального цикла после введения физиологического раствора обнаружено, что в стриатуме через 0,5 часа после воздействия активность фермента в диэструсе и эструсе была достоверно выше, чем в проэструсе. Через 4 часа в том же отделе головного мозга активность КПМ в диэструсе оказалась ниже при сравнении с проэструсом и эструсом. Через 18 часов после внутрибрюшинной инъекции физраствора активность на стадии эструса была выше, чем в диэструсе. Разнонаправленные изменения активности КПМ на разных стадиях эстрального цикла, возможно, свидетельствуют о том, что устойчивость к стрессу у самок изменяется в ходе полового цикла [45].
В гипоталамусе при введении физиологического раствора активность КПМ не изменялась в зависимости от стадии эстрального цикла.
Таким образом, введение физраствора приводит к появлению зависимости активности фермента от стадии эстрального цикла в стриатуме, но не в гипоталамусе.
в) Исследование активности карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс
Активность КПМ на стадии диэструса в гипоталамусе через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг была на 43% выше, а через 18 часов на 39% ниже по сравнению с контрольной группой животных. В стриатуме при введении этанола в дозе 1 г/кг через 4 часа наблюдалось увеличение активности фермента на 118% по отношению к контрольным крысам (рис.3).
На стадии диэструса введение этанола в дозе 4 г/кг не влияло на активность КПМ в гипоталамусе. В стриатуме через 4 и 18 часов инъекция этанола (доза 4 г на кг) приводила к увеличению активности фермента в 3,4 и 1,4 раза соответственно по сравнению с контролем.
В диэструсе обнаружены достоверные отличия во влиянии различных доз этанола в гипоталамусе и стриатуме. При этом в гипоталамусе через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг происходило возрастание активности фермента, а при введении этанола в дозе 4 г/кг активность КПМ не изменялась относительно контроля. В стриатуме через 0,5 и 4 часа после введения алкоголя в дозе 1 г/кг активность фермента была достоверно ниже, чем при инъекции этанола в дозе 4 г/кг.
Согласно результатам дисперсионного анализа в диэструсе зависимость активности КПМ от времени после воздействия в гипоталамусе обнаружена только при введении этанола в дозе 1 г/кг: активность фермента постепенно снижалась при переходе от 0,5 к 18 часам. В стриатуме только при введении физиологического раствора активность фермента зависела от времени: наблюдалось повышение к 0,5 часам и возвращение к исходному уровню к 4 часам, в интервале 4-18 часов активность КПМ статистически достоверно не изменялась (табл. 10).
В проэструсе в гипоталамусе выявлены отличия в активности КПМ от контрольной группы только при введении этанола в дозе 1 г/кг: через 0,5 часа после оказанного воздействия активность фермента уменьшалась по сравнению с контрольными животными на 53%.
В стриатуме на стадии проэструса через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг наблюдалось снижение активности фермента на 53%, а при введении этанола в дозе 4 г/кг - увеличение через 0,5 часа в 2,8 раза по отношению к контрольной группе животных.
Таблица 10. Дисперсионный анализ влияние времени на активность КПМ в диэструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).
Отдел
Воздействие
Fф
Норма
Временные подгруппы
0,5 ч.
4 ч.
18 ч.
Гипоталамус
Физраствор
0,71
-
-
-
-
Этанол 1г/кг
10,25***
2
2
1,5
1
Этанол 4 г/кг
1,50
-
-
-
-
Стриатум
Физраствор
12,93***
1
2
1
1
Этанол 1г/кг
1,55
-
-
-
-
Этанол 4 г/кг
3,89*
1
1
1
1
Достоверные различия между двумя дозами этилового спирта выявлены как в гипоталамусе, так и в стриатуме на стадии проэструса. Если введение этанола дозе 4 г/кг не изменяло активность фермента, то его введение дозе 1 г/кг приводило к уменьшению активности КПМ относительно контроля. В стриатуме через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 4г/кг происходило повышение активности, а при введении этанола в дозе 1 г/кг изменений активности КПМ не было, через 4 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг активность фермента достоверно не изменялась, однако при введении этанола в дозе 1 г/кг наблюдалось уменьшение активности по сравнению с контролем.
Дисперсионный анализ не выявил зависимости активности КПМ от времени в стриатуме на стадии проэструса. В гипоталамусе такая зависимость наблюдалась только при введении этанола в дозе 1 г/кг: при переходе к 0,5 часам активность КПМ понижалась, оставаясь на этом уровне вплоть до 4 часов (табл.11).
Таблица 11. Дисперсионный анализ влияние времени на активность КПМ в проэструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).
Отдел
Воздействие
Fф
Норма
Временные подгруппы
0,5 ч.
4 ч.
Гипоталамус
Физраствор
1,83
-
-
-
Этанол 1г/кг
13,54***
2
1
1
Этанол 4 г/кг
1,98
-
-
-
Стриатум
Физраствор
4,01*
1
1
1
Этанол 1г/кг
4,25*
1
1
1
Этанол 4 г/кг
1,68
-
-
-
На стадии эструса в гипоталамусе через 0,5 и 4 часа не выявлено достоверных отличий в активности КПМ от контроля при введении этанола в дозе 1 г/кг. Только через 18 часов обнаруживалось снижение активности фермента на 39% по сравнению с контрольными самками. В гипоталамусе при внутрибрюшинном введении этанола в дозе 4 г/кг активность КПМ достоверно не изменялась.
В стриатуме в эструсе при введении этанола в дозе 1 г/кг и 4 г/кг активность фермента через 0,5 часа после инъекции составляла 58% и 39% от контрольных величин; между двумя этими дозами этанола обнаружено статистически достоверное отличие. Через другие промежутки времени инъекция этанола не оказывала влияния на активность КПМ.
Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции показал отсутствие статистически значимой зависимости КПМ на стадии эструса (табл.12).
Активность КПМ при внутрибрюшинном введении зависела от стадии эстрального цикла. Так в гипоталамусе при инъекции этанола в дозе 1 г/кг через 0,5 часа и в стриатуме через 4 часа после воздействия активность КПМ была достоверно выше в эструсе и диэструсе по сравнению с проэструсом. В гипоталамусе через 4 часа после инъекции этанола в том же количестве самая
Таблица 12. Дисперсионный анализ влияние времени на активность КПМ в эструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).
Отдел
Воздействие
Fф
Гипоталамус
Физраствор
1,75
Этанол 1г/кг
2,58
Этанол 4 г/кг
0,40
Стриатум
Физраствор
0,63
Этанол 1г/кг
0,56
Этанол 4 г/кг
1,97
высокая активность фермента была в диэструсе, самая низкая - в проэструсе. Через 18 часов после инъекции этанола в дозе 4 г/кг в гипоталамусе и в дозе 1г/кг в стриатуме отмечалась более высокая активность фермента в эструсе по сравнению с диэструсом. В стриатуме через 0,5 часа после введения алкоголя в дозе 1 г/кг активность КПМ на стадии диэструса была выше, чем в проэструсе. При введении этанола в дозе 4 г/кг в стриатуме через 4 часа наблюдалось достоверное повышение активности фермента в диэструсе и эструсе относительно проэструса.
Таким образом, введение этанола вызывает более существенные изменения активности КПМ в стриатуме, чем в гипоталамусе. В обоих исследованных отделах активность фермента зависела от дозы вводимого этанола. Зависимость активности КПМ от времени выявлена в гипоталамусе на стадии диэструса и проэструса (при введении этанола в дозе 1г/кг) и в стриатуме на стадии диэструса (при введении физраствора). Кроме того, в гипоталамусе и стриатуме появляется зависимость активности фермента от стадии эстрального цикла, чего не наблюдалось в норме. Интересно отметить, что, как правило, активность КПМ на стадии диэструса и эструса была достоверно выше, чем в проэструсе.
3.2. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях самцов крыс
3.2.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самцов крыс
а) Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных самцов крыс
Полученные данные о распределении активности КПН в тканях самцов крыс представлены в таблице 13.
Таблица 13. Активность КПН в тканях самцов в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68).
Гипофиз
Гипоталамус
Стриатум
Надпочечники
Семенники
0,458±0,043
0,231±0,017
0,157±0,015
0,072±0,010
0,029±0,008
Максимальная активность фермента у самцов обнаружена в гипофизе, в гипоталамусе активность была примерно в 2 раза ниже, в стриатуме почти в 3 раза ниже, а в надпочечниках и семенниках в 6 раз и 9 раз соответственно ниже, чем в гипофизе.
При сравнении активности КПН у самцов и самок на разных стадиях эстрального цикла обнаружено, что в норме активность фермента в гипофизе не отличается у самок в стадии диэструса и у самцов, но достоверно выше у самок в проэструсе и эструсе на 168% (р<0,001) и 51% (p<0,01) соответственно по сравнению с самцами.
В активности КПН в гипоталамусе и надпочечниках нет половых отличий. В стриатуме отличия зафиксированы между самками на стадии эструса и самцами, причем у первых активность была выше на 24% (p<0,05), чем у последних.
В яичниках активность КПН на стадии проэструса достоверно выше на 224% (p<0,05) по сравнению с семенниками. Вероятно, что КПН, участвуя в обмене пептидов, вовлекается в формирование половых различий, которые существуют в уровне многих биологически активных пептидов [44, 90].
б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов
В гипофизе активность КПН возрастала после введения физиологического раствора через все исследованные промежутки времени: через 0,5 часа на 113%, через 4 часа на 60% и через 18 часов на 106% по сравнению с интактной группой самцов (рис. 4), что согласуется с представлениями об увеличении синтеза АКТГ в ответ на стресс, которым можно считать инъекцию физраствора.
В гипоталамусе через 4 часа после инъекции физраствора наблюдалось снижение активности КПН на 21%, а в стриатуме через тот же промежуток времени происходило увеличение активности фермента относительно интактной группы животных. Приведенные нами данные о повышении активности КПН после введения физраствора в гипофизе и стриатуме согласуются с полученными ранее [38].
В надпочечниках и семенниках не выявлено влияния внутрибрюшинного введения физиологического раствора на активность КПН.
То есть инъекция физраствора приводит к изменению функционирования пепт и т.д.................


Перейти к полному тексту работы



Смотреть похожие работы


* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.