На бирже курсовых и дипломных проектов можно найти образцы готовых работ или получить помощь в написании уникальных курсовых работ, дипломов, лабораторных работ, контрольных работ, диссертаций, рефератов. Так же вы мажете самостоятельно повысить уникальность своей работы для прохождения проверки на плагиат всего за несколько минут.

ЛИЧНЫЙ КАБИНЕТ 

 

Здравствуйте гость!

 

Логин:

Пароль:

 

Запомнить

 

 

Забыли пароль? Регистрация

Повышение уникальности

Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp», которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение уникальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения уникальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии и при повышении уникальности не вставляет в текст скрытых символов, и даже если препод скопирует текст в блокнот – не увидит ни каких отличий от текста в Word файле.

Результат поиска


Наименование:


Диплом Хромосомный мутагенез и факторы его вызывающие. Хромосомы человека и основные типы структурных. Спонтанный хромосомный мутагенез. Специфичность и особенности химического мутагенеза. Культивирование крови, приготовление препаратов хромосом.

Информация:

Тип работы: Диплом. Предмет: Биология. Добавлен: 14.09.2003. Сдан: 2003. Уникальность по antiplagiat.ru: --.

Описание (план):


monax.ru/order/ - рефераты на заказ (более 2300 авторов в 450 городах СНГ).
МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО
ОБРАЗОВАНИЯ РФ

КЕМЕРОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
КАФЕДРА ФИЗИОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ И ВАЛЕОЛОГИИ
Крюкова Ольга Сергеевна

Генотоксические эффекты у детей - подростков
из Чебулинского района Кемеровской области

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА


Научный руководитель :
к.б.н., доцент Дружинин В.Г.


Работа допущена к защите Работа защищена

«___» ______ 2001г. «___» ______ 2001г
Зав. Кафедрой ______ с оценкой


Члены ГАК _____________

Кемерово - 2001

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ . . . . . . . . 3

ГЛАВА 1. Обзор литературы. Хромосомный мутагенез и

факторы его вызывающие . . . . . . 6

1.1. Хромосомы человека и основные типы структурных

мутаций хромосом . . . . . . . 6

1.1.1. Денверская система классификации хромосом . . 7

1.1.2. Основные типы хромосомных перестроек . . . 10

1.1.3. Механизмы возникновения хромосомных перестроек . 15

1.1.4. Принципы учета хромосомных аберраций на стадии

метафазы и общие рекомендации к нему . . . . 20

1.2. Спонтанный хромосомный мутагенез . . . . 24

1.3. Специфичность и особенности химического мутагенеза 25

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ . . . . 29

2.1. Характеристика обследованных групп . . . . 29

2.2. Культивирование крови, приготовление препаратов

хромосом и анализ цитогенетических нарушений . . 30

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ . . . 32

ВЫВОДЫ . . . . . . . . . 38

ЛИТЕРАТУРА . . . . . . . . 39

ВВЕДЕНИЕ

Прогресс генетики человека, как и любой другой фундаментальной медико-биологической дисциплины, может в ближайшем будущем существенно расширить подходы и методы решения задач практической педиатрии и, прежде всего, вопросов профилактики не только наследственных заболеваний, но и различных форм патологии мультифакториального генеза [Бочков, 1995].

Проблема донозологической диагностики заболеваний (или риска их возникновения) имеет особую значимость для промышленных регионов, где неблагоприятному техногенному воздействию подвержены большие группы населения, в том числе - детского. Данные эпидемиологических и экологических исследований однозначно показывают, что к числу таких регионов относится территория Кемеровской области, причем неблагоприятному воздействию загрязнителей окружающей среды подвергаются не только жители промышленных городов, но и население сельскохозяйственных районов.

Известно, что в человеческой популяции существует широкий наследственный полиморфизм порога резистентности к токсическому воздействию факторов среды. Это выражается в дифференциации риска возникновения патологии у разных людей, проживающих в сходных экологических условиях. Так как в сложившихся социально-экономических условиях сложно представить возможность быстрого и коренного улучшения экологических параметров среды, то следует искать иные пути решения проблемы профилактики заболеваемости и прежде всего для тех форм, которые этиологически

связаны с воздействием токсических факторов. В этой связи, изучение адаптивных возможностей организма человека в условиях интенсивного загрязнения среды обитания следует проводить на всех уровнях организации: популяционном, организменном, клеточном и молекулярном. Для каждого из этих уровней характерны собственные методические подходы; в частности, клеточный уровень предполагает использование цитогенетического метода, позволяющего выявить степень напряжения генетических систем и, следовательно, оценивать адаптивные резервы на клеточном уровне. Кроме того, цитогенетический метод позволяет экспертировать качество окружающей среды в части загрязнения ее мутагенными факторами химического и лучевого происхождения.

Анализ индивидуальной резистентности к мутагенному воздействию позволяет выявить людей, имеющих повышенный риск возникновения заболеваний различной этиологии. Следует отметить, что отсутствие к настоящему времени научно обоснованной схемы рекомендаций для лиц, относящихся к группам высокого токсико-генетического риска затрудняет использование данных цитогенетического контроля в практической медицине. Вместе с тем, создание, апробация и внедрение такой схемы имеет важное значение, т.к. позволит проводить реальные профилактические и реабилитационные мероприятия в тех случаях, где это действительно необходимо.

На протяжении ряда лет в лаборатории генетики кемеровского государственного университета проводится мониторинг генотоксических эффектов, наблюдаемых в группах детского и подросткового населения Кемеровской области. Представленная дипломная работа включает в себя результаты цитогенетического обследования подростков, проживающих на территории одного из сельскохозяйственных районов области - Чебулинского, осуществленного в рамках этого мониторинга.

Цель работы: изучить степень и характер генотоксического воздействия факторов среды на подростков, проживающих в Чебулинском районе Кемеровской области.

В соответствии с целью в работе решались конкретные задачи:

1, Оценить частоту и качественный спектр хромосомных мутаций в лимфоцитах крови девочек-подростков - жителей сел Усманка и Дмитриевка Чебулинского района.

2. Сопоставить собственные результаты цитогенетического анализа с данными цитогенетического мониторинга подростков пос. Крапивинский Кемеровской области.

3. Оценить вероятные источники загрязнения окружающей среды генотоксическими агентами на территории Чебулинского района.

ГЛАВА 1. Обзор литературы. Хромосомный мутагенез и факторы его вызывающие.

1.1. Хромосомы человека и основные типы структурных мутаций человека.

Использование культуры лейкоцитов для изучения хромосом человека начато работами Г.К. Хрущева и соавт. (1931), А.Г. Андерса и М.С. Навашина (1936). Хсу (Hsu, 1952) и Хьюгес (Hughes, 1952) независимо предложили использование гипотонического раствора для обеспечения разбрасывания хромосом, т.е. их отделение друг от друга в метафазах. Использование гипотонического раствора совместно с колхицином (Hsu, Pomerat, 1953) дало возможность получать и накапливать хорошие метафазные пластинки. Благодаря анализу хромосом клеток из культуры фибробластов было показано, что число хромосом у человека равно 46 (Tjio, Levan,1956; Ford, Hamerton, 1956).

Современная цитогенетика в первую очередь опирается на изучение хромосом в лейкоцитах человека. Культура лимфоцитов обладает целым рядом преимуществ по сравнению с другими объектами, используемыми в тест-системах. Большим достоинством исследований по структурной изменчивости хромосом в культуре лейкоцитов человека является возможность не только качественного, но и количественного учета, что обеспечивает наглядную четность выводов и объективности результатов анализа. Лейкоциты крови нормальных людей в культуре, в основном свободные от структурных мутаций, подвергаются различным экспериментальным обработкам для выяснения характера и степени мутагенности того или иного воздействия. Вместе с тем кровь может быть взята у людей, которые подвергались в то или иное время воздействию мутагенных факторов. В этом случае, регистрирую характер и число мутаций, можно вскрыть последствия от таких воздействий, изучая структурные мутации хромосом в метафазах (Дубинина, 1977).

В исследованиях по цитогенетике человека было показано, что основные закономерности индуцированного мутагенеза хромосом, качественная характеристика типов структурных изменений и особенности их проявления по разным фазам клеточного цикла в принципе одинаковы с ранее изученным индуцированным мутагенезом в клетках растений и животных. Тоже касается и спонтанного мутагенеза. Для учета структурных мутаций хромосом необходимо знание кариотипа соматических клеток человека и всех основных категорий структурных мутаций хромосом.

1.1.1. Денверская система классификации хромосом.

Обычно классификация хромосом строиться на учете размера каждой из хромосом в кариотипе, по положению центромеры и по другим особенностям. Решениями конференций по хромосомам человека в Денвере США (Denver conference, 1960), в Лондоне (London conference, 1966) сведены обширные материалы из многочисленных литературных источников в систему, имеющую в настоящее время общепризнанный характер. Согласно этой системе, 22 пары аутосом были перенумерованы от 1 до 22-й номере уменьшения их длинны, пара половых хромосом обозначена символами Х и У. Кариотип мужчины - ХУ, женщины - ХХ. 22 пары аутосом разделены на семь групп, обозначаемых буквами от А до G. Каждая группа хромосом характеризуется следующими особенностями (рис 1):

Группа А содержит 3 пары длинных хромосом (1-3), каждую из которых можно легко индивидуализировать. Хромосомы 1,3 являются метацентриками, аромосома 2 - субметацентрична;

Группа В содержит две пары хромосом (4-5). Они короче хромосом из группы А и являются субметацентриками;

Группа С содержит 6 пар аутосом (6-12), все хромосомы с субмедиальным расположением центромеры, средних размеров, их трудно индивидуализировать. К этой группе по размеру относится Х-хромосома, которая отличается тем, что заканчивает синтез ДНК позднее других;

Группа D содержит 3 пары хромосом (13-15). Хромосомы средних размеров имеют почти терминальное расположение центромеры - акроцентрики. Все они имеют спутники, морфологически похожи;

Группа Е состоит из 3 пар коротких хромосом (16-18). Хромосомы 16-й пары являются метацентриками. Хромосомы 17-й и 18-й пары, похожи между собой и являются субметацентриками;

Группа F имеет 2 пары коротких метацентрических хромосом (19-20), которые неотличимы друг от друга;

Группа G состоит из 2-х пар хромосом (21-22). Это очень короткие акроцентрические хромосомы со спутниками, трудно различимы, хотя несколько отличаются по величине и морфологии. К ним примыкают У-хромосома, которая несколько длиннее и имеет на длинном плече вторичную перетяжку (Дубинина, 1977).

В настоящее время для более тонкой дифференциации каждой из хромосом человека разработаны новые методы. Однако для исследования спонтанного хромосомного мутагенеза достаточно применения методики рутинной окраски хромосом, в результате которой все хромосомы перечисленных выше групп в исследуемой метафазной пластинке равномерно окрашиваются и хорошо идентифицируются.

1.1.2. Основные типы хромосомных перестроек.

Все хромосомные аберрации, возникающие в соматических клетках человека и регистрируемые на стадии метафазы, разделяются на две основные группы: аберрации храматидного типа и аберрации хромосомного типа. Согласно наиболее распространенному мнению, аберрации хромосомного типа отражают повреждение хромосомы в пресинтетической стадии (G1 - фаза), когда хромосома реагирует как однонитчатая структура, тогда как аберрации хроматидного типа возникают при повреждении хромосомы на стадии ее двух нитей (фаза S и G2) (Buckton K., Evans H., 1973).

Аберрации хромосомного типа.

Исследования соматических клеток в метафазе показало, что цитологически можно различить 7 видов хромосомных аберраций. Типы аберраций, указанных на рисунке 2 в пунктах а - д, образуются в одной хромосомы и могут быть названы внутрихромосомными обменами, а аберрации, указанные в пунктах е и ж, сопровождаются обменом участками между различными хромосомами и называются межхромосомными обменами.

а) Ацентрические фрагменты (терминальные делеции) представляют собой спаренные хроматиды, которые располагаются параллельно друг другу, но не имеют центромеры.

б) Малые фрагменты (интерстициальные, изодиаметрические делеции) - спаренные хроматиды меньшего размера, чем ацентрические фрагменты, имеющие характерный вид спаренных хроматиновых шариков.

в) Ацентрические кольца - спаренные хроматиды в форме кольца, не содержащие центромеры. Различия между малыми фрагментами и кольцами часто бывают произвольными, поскольку они основаны лишь на длине не достигающего интерстициального участка хромосомы.

г) Центрические кольца - спаренные хроматиды в форме кольца, имеющие центромеру.

д) Перецентрические инверсии - результат инверсии сегмента, содержащего центромеру, с последующим его включением в ту же хромосому.

е) Симметрические межхромосомные обмены (реципроктные транслоказы) - аберрации, возникающие в результате обмена между двумя хромосомами, причин дистальные участки двух хромосом транслоцируются от одной к другой.

ж) Асимметричные межхромосомные отмены (дицентрические, полицентрические аберрации). Возникают в результате обмена между двумя или несколькими хромосомами, происходящие таким образом, что проксимальные участки хромосом соединяются, образуя дицентрическую или полицентрическую структуру с сопутствующим ацентрическим пробелом.

Аберрации хроматидного типа.

Аберрации хроматидного типа представлены на рисунке 3. К ним относятся хроматидные разрывы (фрагменты хроматид) и хроматидные обмены. Фрагменты могут быть концевыми интерстициальными и точковыми. Если произошли изохроматидный разрыв и поврежденные концы сестринских хроматид соединились, то из-за притяжения сестринских хроматид на остальной части они остаются лежать параллельно и потому имеют вид дуги. Хроматидные фрагменты, малоудалённые от места повреждения, необходимо дифференцировать от ахроматических пробелов, представляющих собой неокрашенные участки хромосом (частки локальной деспирализации хромосом). О фрагментах говорят в трех ситуациях:

1. Фрагмент сдвинут по длине. 2. Перевернут. 3. Сдвинут по оси.

Обмены хроматидного типа крайне многообразны. Они могут быть между хроматидами одной хромосомы, двух и более хромосом. Кроме того, различают полные и неполные, симметричные и ассиметричные обмены. Все это создает возможность образование большого числа форм обменов. При межхромосомных обменах образуются фигуры три-, квадри-, и мультирадианов, или неправильных форм. Структура обменной аберрации зависит от величины обмениваемых участков, гомологичности хромосом, идентичности плеч, симметричности (эуцентричности) и полноты (рецепроктности) обмена.

1.1.3. Механизмы возникновения хромосомных перестроек

Хромосомные перестройки - это обширный и гетерогенный класс наследственных изменений, включающий выпадение (потери). Добавления (удвоение, умножение) участков хромосом, а также их перемещения в пределах одной хромосомы или между хромосомами.

Исторически эксперименты и теоретически построения по индуцированному мутагенезу значительно опередили работы по выяснению природы генетического материала хромосом. Однако после 1953, когда в работе Д. Уотсона и Ф. Крика (D. Watson, F. Crick,1953) было сделано предположение о структуре молекулы ДНК, о полуконсервативном характере об репликации и о возможной молекулярной природе мутаций, открылась возможность для конкретных исследований как характера повреждений в ДНК, индуцируемых различными мутагенами, так и реальных механизмов репарации этих повреждений. В монографии Н.П. Дубинина (1978) приведены сведения о повреждениях ДНК различными мутагенами.

Обширный класс алкилирующих соединений может производить алкилирование (присоединение метильной или этильной группы) в некоторых позициях к азотистым основаниям (чаще всего к гуанину) или к фосфатным группам полинуклиотидной нити. Алкилированные азотистые основания за счет гидролиза выщепляются из цепочки ДНК, в следствии чего появляются апуриновые или апиримидиновые сайты. В таких сайтах далее может идти гидролиз нестабильных дезоксирибозидных остатков, и в результате возникают однонитевые разрывы в ДНК. Разрывы могут быть и следствием гидролиза после алкилирования фосфатных групп.

Бифункциональные алкилирующие соединения (серный и азотный иприт,митомицин C) своими двумя алкильными группами могут алкилировать сразу два гуанина из двух комплементарных нитей ДНК, образуя при этом внутримолекулярную сшивку.

Такие сшивки - типичный результат воздействия на ДНК также азотистой кислоты и ее солей.

Как видно, большинство первичных изменений в ДНК, вызываемых мутагенами, сами по себе еще не мутации, т.е. не являются изменениями в последовательности нуклеотидов. Эта последовательность может быть изменена только после прохождения поврежденной молекулы через этап репликации. Так, при репликации молекулы, в одну из нитей которой встроена молекула акридинового красителя, против этой поврежденной нити строиться комплементарная ей цепочка, содержащая лишний нуклеотид, вставленный против места, где в поврежденной цепи интеркалирована молекула акридина. Такая вставка нуклеотида, закрепляющаяся в обеих нитях молекулы после еще одной репликации - это уже мутация, обозначаемая как “сдвиг рамки считывания” (frame shift). Сшивки в молекуле ДНК обычно летальны, т.к. не позволяют осуществлять нормальную репликацию из-за невозможности расплетения нитей в месте сшивки. (Смирнов В.Г. 1991).

Однако в работах Р. Кимбола (R. Kimball, 1966) указывалось, что клетка способна к репарации повреждений в ДНК, вызванных действием мутагенов.

В большинстве случаев первичных повреждений после первой же репликации (если они не были репарированны до репликации) напротив них во вновь синтезированной нити ДНК появляется брешь. Ю.А. Митрофанов и Г.С. Олимпиенко (1980) именно состояние такого разрыва в одной из комплементарных нитей ДНК и считают потенциальным повреждением, которое при одних условиях может быть репарировано, а при других - превращается в двунитевый разрыв в молекуле ДНК (хроматидный разрыв).

A. Bender с соавторами ( Bender et al., 1973) считают, что при разрыве в одной из нитей двунитевой молекулы ДНК неповрежденная нить может разрезаться напротив разрыва ДНК-азой, специфичной для однонитевой ДНК.

Полагается, что такой механизм материализует идею резонансного мутагенеза - перенося повреждения с поврежденной нити на неповрежденную.

По мнению Смирнова В.Г. (1991) обменные перестройки при воздействии самыми разными мутагенами возникают благодаря одному и тому же механизму, характеризующемуся воссоединением концов появляющихся разрывов. Условием этого является тесная пространственная ассоциация между участками хроматид одной хромосомы или разных хромосом. При наличии такой ассоциации возникающие в хроматидах разрывы воссоединяются подобно тому, как это происходит при кроссинговере (Беляев И.Я., Акифьев А.П., 1988).

Разные исследователи неоднократно обращали внимание на сходство между процессом кроссинговера и образованием обменных перестроек при контакте хроматид. Впервые такую мысль высказали А.С. Серебровский и Н.П. Дубинин (1929), а затем “Обменную гипотезу” о механизме возникновения перестроек предложил С. Ривелл (S. Revell, 1955, 1974). Результаты, полученные И.Я. Беляевым и А.П. Акифьевым (1988), свидетельствуют о плодотворности сопоставления этих двух процессов.

Ассоциации, между участками хроматид одной хромосомы или разных хромосом, могут устанавливаться между районами хромосом, содержащими высокоповторяющиеся последовательности ДНК. Такие последовательности сосредоточены в гетерохроматиновых районах хромосом - в прицентромерном и интерколярном структурном гетерохроматине. Именно для гетерохромотиновых районов неоднократно описаны цитологически наблюдаемые ассоциации не гомологичных хромосом.

Образование хромосомных аберраций возможно не только на основе рекомбинации в районах локализации высокоповторяющихся не кодирующих последовательностей ДНК, но и на основе рекомбинации между повторяющимися генами, при наличии дубликаций в геноме.

Так же основой для возникновения хромосомных перестроек по рекомбинационному механизму может быть присутствие в геноме значительного числа копий различных мобильных элементов (Смирнов В.Г. 1991).

Вопрос о механизме возникновения хромосомных перестроек стал активно обсуждаться сразу же после установления возможности индуцировать, усилить мутационный процесс при воздействии такого возможного фактора, как различные виды ионизирующих излучений (Г.А. Карсон, Г.С. Филиппов, 1925; Н. Миллер, 1927; L. Stadler, 1928).

А. Стадлер (L. Stadler, 1928) и М.С. Навашин (1931) считали, что первичный эффект в действии Х-лучей на хромосомы - возникновение разрывов. Это положение легко в основу широко известной гипотезы о механизме возникновения индуцированных хромосомных перестроек, созданной в работе К. Сакса (K. Sax, 1938-1942) и Д. Ли (D. Lea 1963, D. Catcheside 1942). В зависимости от стадии клеточного цикла возникают либо хромосомные (при облучении в период G1 до фазы S), либо хроматидные (при облучении в фазах S и в начале G2) разрывы. Большая их часть затем вновь воссоединяется с восстановлением исходной структуры (реституция). Однако если разрывы в разных местах одной хромосомы (или хроматиды) или в разных хромосомах (или хроматидах) в один и тот же момент локализируется близко друг к другу, они могут воссоединится таким образом, что возникают хромосомные или хроматидные делеции (нехватки), транслокации, инверсии, вставки, образуются центромерные или бесцентромерные кольцевые хромосомы, бесцентромерные фрагменты. Отдельные фрагменты, появившиеся сразу в результате возникновения разрывов, могут сохраняться как таковые и без воссоединения с какими-либо другими.

Довольно скоро были получены убедительные данные о возможной модификации мутагенного эффекта излучений благодаря действию дополнительных факторов (температура, инфракрасный свет, понижение концентрации кислорода), из которых каждый сам по себе не оказывал влияние на спонтанный уровень мутационного процесса. Так в опытах К. Свенсона и А. Холлендера (C. Swenson, A. Hollaender, 1946) было показано, что обработка микроспор традесканции инфракрасным светом до или после облучения Х-лучами приводит к значительному увеличению частоты как хроматидных делеций, так и межхромосомных перестроек, причем в максимальной степени этот эффект инфрактасных лучей был выражен при температуре 12 градусов С и уменьшался при более низкой температуре.

Опыты такого рода заставили предположить, что ионизирующее излучение вызывает не только разрывы хромосом, но и некоторые предмутационные, потенциальные изменения в них, которые при дополнительном воздействии слабее действующих факторов могут реализоваться в дополнительные разрывы и перестройки (Смирнов А.Г. 1991).

1.1.4. Принципы учета хромосомных аберраций на стадии метафазы и общие рекомендации к нему.

Окрашенные препараты начинают анализировать под небольшим увеличением микроскопа, чем достигается общая оценка препарата, а именно митотическая активность и наличие метафазных пластинок. Для анализа хромосом требуется иммерсионный объектив.

При проведении метафазного анализа возможны два подхода к учету хромосомных аберраций: с кариотипированием метафазной пластинки и без кариотипирования. Первый подход наиболее точен, но он трудоемок и может быть применен в специальных исследованиях (например, при изучении распределения повреждений по группам хромосом, по длине отдельных хромосом). Второй подход наиболее употребителен и дешев при быстром решении вопроса (Priest, 1969). Так, например, при оценке мутагенности факторов внешней среды достаточно учитывать хромосомные аберрации без кариотипирования.

При анализе обмена наиболее полная информация включает ответы на следующие вопросы:

1) число вовлеченных в обмен хромосом и хроматид;

2) симметричность транслокаций (эу - или анэуцентричность);

3) реципроктность (полнота);

4) гомологичность вовлеченных в обмен хромосом и их идентификация;

5) сравнительная величина участников при транслокации между гомологичными хромосомами.

При анализе каждой аберрации необходимо помнить об одном факте: гомологичные участки сестринских хроматид взаимно притягиваются независимо от их перемещения.

Распознавание парных ацентрических фрагментов обычно не вызывает затруднений. Они могут быть очень маленькими, еле заметными и т.д.................


Перейти к полному тексту работы



Смотреть похожие работы


* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.