На бирже курсовых и дипломных проектов можно найти готовые бесплатные и платные работы или заказать написание уникальных курсовых работ, дипломов, лабораторных работ, контрольных работ, диссертаций, рефератов по самым низким ценам. Добавив заявку на написание требуемой для вас работы, вы узнаете реальную стоимость ее выполнения.

ЛИЧНЫЙ КАБИНЕТ 

 

Здравствуйте гость!

 

Логин:

Пароль:

 

Запомнить

 

 

Забыли пароль? Регистрация

Быстрая помощь студентам

 

Результат поиска


Наименование:


Статья Представлены данные по биосинтезу дейтерий-меченных аминокислот L-фенилаланин-продуцирующим штаммом факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum. В культуральной жидкости накапливаются и аланин, валин и лейцин (изолейцин).

Информация:

Тип работы: Статья. Предмет: Биология. Добавлен: 23.10.2006. Сдан: 2006. Уникальность по antiplagiat.ru: --.

Описание (план):


ИЗУЧЕНИЕ БИОСИНТЕЗА АМИНОКИСЛОТ ШТАММОМ Вrevibacterium methylicum ПРИ РОСТЕ НА СРЕДАХ, СОДЕРЖАЩИХ ТЯЖЕЛУЮ ВОДУ И ДЕЙТЕРО-МЕТАНОЛ.
О. В. МОСИН
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, г. Москва, просп. Вернадского, д.86.
Представлены данные по биосинтезу дейтерий-меченных аминокислот L-фенилаланин-продуцирующим штаммом факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum. Аминокислоты разной степени изотопной замещенности на дейтерий, как секретируемые в культуральную жидкость в процессе ферментации штамма-продуцента, так и в составе гидролизатов суммарных белков биомассы, были получены за счет биоконверсии СН3ОН/CD3OD на средах, содержащих различные концентрации тяжелой воды, включая 24,5 об. % D2O вплоть до 98 об.% D2O. Для изучения степеней включения дейтерия в аминокислоты использовали метод масс-спектрометрии электронного удара метиловых эфиров N-диметиламино-5-нафталин-сульфонильных (дансильных) производных аминокислот. Степени изотопного включения дейтерия в фенилаланин, секретируемый в культуральную жидкость и в составе гидролизатов суммарного белка изменяются от 27,5 до 95 % в зависимости от концентрации D2O в среде. Показано, что при ферментации наряду с основным продуктом биосинтеза (фенилаланин) в культуральной жидкости накапливаются другие аминокислоты , такие как аланин, валин и лейцин (изолейцин).

ВВЕДЕНИЕ
Метод мечения стабильными изотопами является ключевым направлением в разнопрофильных биохимических исследованиях с использованием аминокислот и других биологически активных соединений (БАС) [1,2]. Тенденции к предпочтительному применению стабильных изотопов, в частности, дейтерия по-сравнению с радиоактивными аналогами обусловлены такими их преимуществами, как отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле прямыми методами. Интенсивное развитие изотопно-чувствительной техники, прежде всего спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной и лазерной спектроскопии и масс-спектрометрии (МС), за последние годы позволило значительно усовершенствовать проведение многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия клеточных БАС на молекулярном уровне [3,4].
Начиная с первых экспериментов Катца с соавт. [5] по культивированию микроводорослей Chlorella на тяжелой воде продолжаются разработки методических подходов по получению БАС, в том числе аминокислот, меченных дейтерием. Потребности в дейтерированных аминокислотах обусловлены их важной ролью в разнообразных биохимических и медицинских исследованиях, а также возможностью их использования в синтезах широкого круга дейтерированных БАС, например, в синтезах пептидных гормонов и нейротрансмиттеров с использованием L-фенилаланина [6-8].
В настоящее время биотехнологический потенциал метилотрофных бактерий для получения аминокислот, меченных стабильными изотопами, в частности, дейтерием, общепризнан [9]. Современные методы мутагенеза и селекции открывают широкие перспективы для получения новых С1 -утилизирующих штаммов-продуцентов аминокислот, пригодных для роста на D2O. В связи с этим, большой практический интерес представляет исследования процессов биосинтеза аминокислот генетически маркированными штаммами метилотрофных бактерий, которые устойчивы к высоким концентрациям дейтерия в ростовых средах.
Раннее нами была изучена возможность использования штамма факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum для получения дейтерированного фенилаланина [10]. В отличие от традиционных штаммов-продуцентов фенилаланина, у которых нарушены активности префенатдегидратазы или дезоксиарабиногептулозофосфатсинтетазы, уникальность этого штамма состоит в том, что для биосинтеза L-фенилаланина необходим L-лейцин.
Целью настоящей работы было изучение уровней включения дейтерия в молекулы аминокислот штамма B. methylicum как секретируемых в культуральную жидкость, так и аминокислот в составе белковых гидролизатов биомассы этих бактерий на средах с различным содержанием СН3ОН/CD3OD и D2O в них.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА.
Бактериальные штаммы. Исследования проводили с L-лейцин-зависимым штаммом факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum, продуцентом L-фенилаланина. Штамм был получен из коллекции культур Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.
Для приготовления питательных сред с различным содержанием дейтерия в них (см. табл.1) использовали безводные соли квалификации “х.ч.”, D2O (99,9% D) и СD3ОD (97,5 %D), полученные из Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ). По необходимости тяжелую воду очищали от вредных примесей, перегоняя ее над перманганатом калия. Для получения производных аминокислот использовали N-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид) (Sigma, CША) и диазометан. Диазометан получали из N-нитрозометилмочевины (Мerck, Германия).
Культивирование штамма В. methylicum проводили на минимальных средах М9 [11] как описано в работе [10].
Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ-метанол (2:1) по методу Блайя и Дайера [12].
Щелочной гидролиз белка. Белок (4-5 мг) гидролизовали в запаянных стеклянных ампулах в 5 мл 4 н. Ba(OH)2 в течение 24 ч при 110 0С. Гидролизаты суспендировали в 20 мл горячей дист. воды и нейтрализовали 2 н. раствором H2SO4 с последующим отделением осадка центрифугированием (10 000 об/мин, 5 мин). Гидролизаты упаривали в роторном испарителе при 400 С.
Получение дансиламинокислот культуральной жидкости. К 200 мг лиофилизованных препаратов культуральной жидкости в 5 мл 2 м. NaHCO3 (2 10-3 моль) рН 9-10 дробными порциями при перемешивании добавляли 320 мг (1,2 10-3 моль) дансилхлорида в 5 мл ацетона. Реакционную смесь выдерживали при перемешивании при 400 С в течении часа, затем подкисляли 2 м. раствором HCL до рН 3,0 и экстрагировали этилацетатом (3 раза по 5 мл). Объединенный экстракт промывали водой до значения рН 7,0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.
Дансиламинокислоты в составе белковых гидролизатов B. methylicum получали как описано в работе [9].
Получение метиловых эфиров дансиламинокислот. К 20 мл 40 %-ного КОН в 40 мл эфира добавляли 3 г влажной нитрозометилмочевины и перемешивали на водяной бане со льдом в течении 15-20 мин. После интенсивного газовыделения эфирный слой отделяли и промывали ледяной водой до рН 7,0, сушили безводным NaSO4 и обрабатывали им препараты дансилпроизводных аминокислот в составе культуральной жидкости и гидролизатов белка биомассы.
Количественное определение L-фенилаланина в культуральной жидкости проводили на спектрофотометре“Beckman DU-6” (США) при 540 нм после обработки препаратов культуральной жидкости нингидрином, как указано в работе [10].
Масс-спектры электронного удара производных аминокислот получены на приборе “MB-80A” (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Получение дейтерий-меченных аминокислот и их масс-спектрометрический анализ.
Данные по росту штамма B. methylicum и максимальному уровню накопления фенилаланина в культуральной жидкости на средах с 2 об.% СН3ОН (СD3OD), содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации D2O представлены в таблице 1. Как видно из данных таблицы, рост исследуемых бактерий на средах с возрастающими концентрациями тяжелой воды сопровождался изменением выходов биомассы, времени клеточной генерации и продолжительности лаг-фазы при сохранении способности синтезировать и накапливать фенилаланин в культуральной жидкости. Поэтому было необходимо изучить, как изменяются степени включения дейтерия в фенилаланин и аминокислотные остатки суммарных белков биомассы B. methylicum в этих условиях.
ТАБЛИЦА 1.
Влияние изотопного состава среды на рост штамма B. methylicum и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости.
Номер Компоненты среды, об% Величина Выход Время ген.
опыта лаг-фазы биомассы часы секреции
Н2О 2Н2О СН3ОН С2Н3О2Н часы % L-Phe,
1
98
0
2
0
24,0
100
2,2
100
2
98
0
0
2
30,3
92,3
2,4
99,1
3
73,5
24,5
2
0
32,1
90,6
2,4
96,3
4
73,5
24,5
0
2
34,7
85,9
2,6
97,1
5
49,0
49,0
2
0
40,5
70,1
3,0
98,0
6
49,0
49,0
0
2
44,2
60,5
3,2
98,8
7
24,5
73,5
2
0
45,8
56,4
3,5
90,4
8
24,5
73,5
0
2
49,0
47,2
3,8
87,6
9
0
98,0
2
0
60,5
32,9
4,4
79,5
10
0
98,0
0
2
64,4
30,1
4,9
71,5
Для определения степени включения дейтерия в аминокислоты методом масс-спектрометрии электронного удара использовали метиловые эфиры дансил-аминокислот, которые химически стабильны и дают интенсивные пики молекулярных ионов в масс спектрах [13]. В качестве примера на рис.1 показана фрагментация метилового эфира дансилфенилаланина при электронном ударе. В масс-спектрах этого производного, как правило, четко детектируется пик молекулярного иона метилового эфира дансилфенилаланина М+. с m/z 412. Пик аминного фрагмента А имеет невысокую интенсивность, а пик аминоацильного фрагмента В крайне низкую или вообще отсутствует (см. рис. 1). Интенсивности пиков аминных А и аминоацильных В фрагментов других производных аминокислот, например присутствующих в культуральной жидкости аланина, валина и лейцина (изолейцина) при электронном ударе также сопоставимы. Кроме вышеобозначенных пиков, в масс-спектрах электронного удара метиловых эфиров дансил-аминокислот фиксируются пики с m/z 250, 234, 170, которые соответствуют дансильному фрагменту и продуктам его распада до N-диметиламинонафталина.

Модификация метода получения метиловых эфиров дансил-аминокислот заключалась в прямой обработке препаратов культуральной жидкости, полученной после отделения клеток, дансилхлоридом и диазометаном. В результате применения этого подхода удалось получить чётко интерпретируемые масс-спектры электронного удара метиловых эфиров дансил-аминокислот в присутствии следовых количеств низкомолекулярных метаболитов среды и сопутствующих аминокислот не прибегая к их предварительному хроматографического разделению и очистке. Следует отметить, что в условиях проведения дансильной дериватизации, для основной аминокислоты лизина характерно образование ди-дансильных производных, а для тирозина также происходит дополнительное дансилирование по гидроксильной -ОН-группе. При этерификации аминокислот диазометаном не исключено дополнительное N-метилирование по а-NH2-группе аминокислот, что приводит к появлению в масс-спектре метиловых эфиров дансил-аминокислот пиков, соответствующих соединениям с молекулярной массой на 14 массовых единиц больше исходных [14]. В качестве примера на рис. 2,б приведен масс-спектр секретируемого фенилаланина и сопутствующих аминокислот в сос и т.д.................


Перейти к полному тексту работы



Смотреть похожие работы


* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.