На бирже курсовых и дипломных проектов можно найти образцы готовых работ или получить помощь в написании уникальных курсовых работ, дипломов, лабораторных работ, контрольных работ, диссертаций, рефератов. Так же вы мажете самостоятельно повысить уникальность своей работы для прохождения проверки на плагиат всего за несколько минут.

ЛИЧНЫЙ КАБИНЕТ 

 

Здравствуйте гость!

 

Логин:

Пароль:

 

Запомнить

 

 

Забыли пароль? Регистрация

Повышение уникальности

Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp», которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение уникальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения уникальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии и при повышении уникальности не вставляет в текст скрытых символов, и даже если препод скопирует текст в блокнот – не увидит ни каких отличий от текста в Word файле.

Результат поиска


Наименование:


Реферат Принципиальные черты устройства автоматических секвенаторов, основные элементы прибора ABI Prism 377, его конструкция и этапы реакции. Ультрацентрифуги как главная часть приборного оснащения биохимической лаборатории, рабочие параметры и применение.

Информация:

Тип работы: Реферат. Предмет: Биология. Добавлен: 11.12.2009. Сдан: 2009. Уникальность по antiplagiat.ru: --.

Описание (план):


Реферат на тему:
Конструкция модели секвенатора ДНК



2009

1. Автоматический секвенатор
Конструкция модели секвенатора ДНК. Эти конструкции непрерывно совершенствуются. Однако принципиальные черты устройства автоматических секвенаторов, по-видимому, в ближайшие годы сохранятся для всех моделей. Поэтому здесь я остановлюсь более или менее подробно на описании основных элементов конструкции прибора ABI Prism 377, выпущенного в 1995 году.
В основном блоке электрофореза, как и в любом приборе с вертикально стоящими пластинами, имеются верхний и нижний резервуары для буфера, электроды и источник напряжения. Ввиду последующего оптического сканирования обеспечивается строго фиксированная установка сменных пластин с ПААГ. Возможно использование гелей различной концентрации (обычно в пределах 4,5-6%). Толщина геля -- менее 1 мм. Ширина рабочей его части -- 16 см. Длину пластины можно выбрать в 24, 34 и 48 см. В верхней части геля имеется 36 карманов для препаратов. Таким образом электрофорез можно вести одновременно в 36 треках. Предусмотрен отвод выделяющегося при этом тепла.
Особенностью готовой пластины с гелем является наличие «окна» в нижней части пластины. Окно высотой в 2 см вырезано по всей ширине рабочей части пластины и отстоит на 2,5 см от ее нижнего края. Наличие окна связано с принципиально иным, чем было описано ранее, способом регистрации полос после прекращения электрофореза, обусловленного тем, что наиболее быстро мигрирующая полоса достигала нижнего края пластины. В этом случае медленно мигрирующие полосы, соответствующие более крупным отрезкам ДНК, теснились в верхней части геля и были трудноразделимы при анализе рентгеновской пленки.
В автоматическом секвенаторе полосы в геле проходят мимо окна, регистрируются в процессе этого прохождения и далее покидают гель, уходя в резервуар с нижним буфером. При достаточной продолжительности, электрофореза (16--20 часов) мимо окна проходят все полосы, в том числе те, в которых мигрируют самые длинные отрезки ДНК, несущие флюоресцентную метку. Регистрация производится оптическим способом -- по флюоресценции. Для этой цели используется следующий набор инструментов:
1. Луч аргонового лазера фокусируется в точку на середине высоты окна. Сам лазер установлен на каретке возвратно-поступательно перемещающейся на всю ширину окна, прочерчивая таким образом тонкую линию, пересекающую все треки разделения ДНК. За то время, когда в каком-либо из треков мимо окна проходит одна из полос, содержащая меченые отрезки ДНК определенной длины, эта полоса сканируется лучом лазера много раз по всей ее толщине в направлении миграции.
2. Возникающее при этом излучение флюоресценции определенного цвета (и постепенно изменяющейся интенсивности) проецируется оптической системой на входную щель спектрофотометра и падает на отражающую дифракционную решетку. В зависимости от длины волны флюоресценции дифракционная решетка отражает цветной луч в определенное положение на выходе спектрофотометра. Информация об этом положении поступает в компьютер, обеспечивая идентификацию дидезоксирибонуклеотида, которым заканчиваются данные отрезки ДНК.
3. Выходя из спектрофотометра, луч попадает в камеру для измерения его интенсивности, где используется явление фотоэлектронной эмиссии. Соответствующий электрический сигнал также поступает в компьютер.
4. В компьютере регистрируются и все перемещения лазера поперек пластины геля, что позволяет разнести вышеназванную информацию по его трекам.
5. Для каждого трека отдельно, по мере прохождения в нем полос любого цвета флюоресценции, компьютер ведет их счет, определяя тем самым последовательность нуклеотидов во всех секвенируемых одновременно фрагментах ДНК.
6. Все картины прохождения флюоресцирующих полос мимо окна пластины в каждом треке в реальном времени проецируются на дисплей прибора.
7. По окончании процесса электрофореза полученные данные обрабатываются компьютером и печатаются в виде четырехцветных графиков для каждого трека, где видна вся картина следования пиков, их нумерация и однобуквенные обозначения соответствующих нуклеотидов. Благодаря измерению интенсивности каждого цвета флюоресценции вершины пиков хорошо различимы.
Здесь необходимо сделать небольшое отступление. Хотя и было сказано, что рассматривать различные модели секвенаторов не имеет смысла, об одной из них, принадлежащей к последнему поколению, стоит вкратце написать и вот почему. Принципиальное его устройство такое же, но в интересах дальнейшего повышения продуктивности применена новинка, общие перспективы которой следует обсудить. Электрофорез в этом приборе ведут не на пластине геля, а в капиллярах! Вот, как это делается.
В прибор (Beckman СЕФ-2000) устанавливают плашку на 96 лунок (12 рядов по 8 лунок), куда заранее вносят продукты реакций, проведенных по тому же методу Сэнджера с четырьмя люминесцентно мечеными дидезоксирибонуклеотидами. Тандемом к ней ставят вторую точно такую же плашку, лунки которой заполнены буфером. Сам ПААГ готовят так, что он не может запо-лимеризоваться до твердого состояния, а представляет собой вязкую жидкость. Прибор заряжают картриджем, заполненным таким гелем. Восемь тонких и гибких пластмассовых капилляров, длиной около метра, с одного конца закреплены в пластине так, что расстояние между ними равно расстоянию между лунками одного ряда плашки. Концы капилляров выступают из пластины и одеты металлическими трубочками, электрически соединенными с катодом источника высокого напряжения. Благодаря этому в каждую лунку, куда опускаются кончики капилляров, подается отрицательное напряжение электрофореза. Вторые концы капилляров собраны в некий зажим, где они располагаются в одной плоскости вплотную друг к другу. Выходя из дальнего конца этого зажима все восемь капилляров открываются в одну емкость с буфером, куда подается положительное напряжение электрофореза. Но перед этим в окне зажима, против которого приходятся прозрачные участки капилляров, все они сканируются лучом лазера и «отвечают» на это флюоресценцией проходящего мимо фрагмента ДНК. Далее все происходит так же, как описано для секвенатора с пластиной геля.
Но вернемся к началу операции. Первоначально пустые капилляры при помощи насоса целиком заполняются гелем из картриджа. Затем концы их автоматически переносятся и опускаются в восемь лунок первого ряда плашки препаратов. Включается умеренное напряжение и все отрицательно заряженные фрагменты ДНК в течение нескольких секунд входят в гель -- из каждой лунки в «свой» капилляр. После этого концы капилляров автоматически переносят в лунки первого ряда плашки с буфером. Напряжение повышается до рабочей величины электрофореза, который продолжается 2 часа. По его окончании гель, с помощью того же насоса выталкивается из капилляров, а сами они промываются водой. Затем капилляры заполняются новыми порциями геля и все операции повторяются для второго ряда лунок с препаратом. И так до последнего, 12-го ряда. За 24 часа прибор может провести электрофорез 96-ти препаратов. Если в одном капилляре удается расшифровать последовательность в 500 нук-леотидов, то всего за одни сутки прибор может определить последовательность для 49 тысяч нуклеотидов. Кроме того оператор освобождается от трудоемкого приготовления пластин с гелем и деликатной операции внесения исходных препаратов в его «карманы».
Технический прогресс впечатляет. Но поясню, ради чего было сделано это отступление. Каковы перспективы электрофореза в капиллярах? Не вытеснит ли он классический метод электрофореза в пластинах? Думаю, что не вытеснит и вот почему. В капиллярном методе у экспериментатора нет возможности получить в свое распоряжение сам чистый гель без оболочки, а значит и решить целый ряд задач, описанных в гл. 6. К примеру, как использовать электрофорез в капиллярах для сравнения картин распределения по размерам белков или НК разного происхождения? Пометить их всех люминесцентной меткой и протягивать сплошь прозрачные капилляры мимо лазера, фиксируя времена прохождения каждого из белков или НК? Сложно! А если возникнет необходимость подробнее познакомиться с одним из белков? Найти его снова по времени регистрации и вырезать кусочек капилляра? Или, не меняя описанной конструкции фиксировать времена выхода всех белков из капилляров и сохранять их для последующего анализа? Тогда для каждого капилляра надо поставить свой коллектор фракций, как при хроматографии! А если белки или НК помечены радиоактивной меткой? Укладывать капилляры с гелем на рентгеновскую пленку? Для регистрации в таких условиях потребуется очень большая радиоактивность. Еще хуже с использованием иммунохимических методов для отыскания нужного антигена после электрофореза смеси белков. К белкам в капилляре не подобраться. Значит тестировать антисывороткой поодиночке каждый белок в варианте с коллекторами фракции? И так далее.
Все это очень трудно. Быть может технически разрешимо за счет усложнения и удорожания специальной аппаратуры. Но зачем? Ведь, кроме секвенирования ДНК, при проведении любой другой исследовательской работы электрофорез используется не более, чем несколько раз... Но вернемся к прерванному рассмотрению вопроса об использовании автоматических секвенаторов.
Уже упоминалось, что в одном треке пластины или в капилляре автоматического секвенатора удается надежно определить оследовательность нуклеотидов во фрагменте ДНК длиной в 500-600 пар нуклеотидов. Каким же образом расшифровывают весь геном, хотя бы бактерии, где счет идет на миллионы пар? Очевидно здесь пока нет иного пути, чем разбиение всей ДНК генома на куски: сначала более крупные, потом мельче -- вплоть до набора фрагментов, доступных для автоматического секвени-рования. Средством разбиения могут служить различные рест-риктазы или облучение ультразвуком. Сортировку кусков и фрагментов ДНК по размерам можно вести последовательно электрофорезом в мягких гелях агарозы с последующим извлечением их из этих гелей. Отбираются только достаточно крупные фрагменты.
Д и т.д.................


Перейти к полному тексту работы



Смотреть похожие работы


* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.