Здесь можно найти образцы любых учебных материалов, т.е. получить помощь в написании уникальных курсовых работ, дипломов, лабораторных работ, контрольных работ и рефератов. Так же вы мажете самостоятельно повысить уникальность своей работы для прохождения проверки на плагиат всего за несколько минут.

ЛИЧНЫЙ КАБИНЕТ 

 

Здравствуйте гость!

 

Логин:

Пароль:

 

Запомнить

 

 

Забыли пароль? Регистрация

Повышение уникальности

Предлагаем нашим посетителям воспользоваться бесплатным программным обеспечением «StudentHelp», которое позволит вам всего за несколько минут, выполнить повышение уникальности любого файла в формате MS Word. После такого повышения уникальности, ваша работа легко пройдете проверку в системах антиплагиат вуз, antiplagiat.ru, etxt.ru или advego.ru. Программа «StudentHelp» работает по уникальной технологии и при повышении уникальности не вставляет в текст скрытых символов, и даже если препод скопирует текст в блокнот – не увидит ни каких отличий от текста в Word файле.

Результат поиска


Наименование:


Курсовик Теория переходного состояния при изучении переносчиков и разнообразия их функций. Переносчики как ферменты: применение теории скоростей. Симпортеры, антипортеры и унипортеры. Группа митохондриальных переносчиков. Переносчик глюкозы из мембраны эритроц

Информация:

Тип работы: Курсовик. Предмет: Биология. Добавлен: 13.04.2009. Сдан: 2009. Уникальность по antiplagiat.ru: --.

Описание (план):


2
Министерство образования и науки Российской Федерации
Пензенский государственный педагогический университет
им.В.Г. Белинского.
Кафедра биохимии
Курсовая работа
на тему:
Строение и принцип действия переносчиков
Выполнил: студентка
4 курса группы БХ-41
Живаева Любовь
Проверил:
к. б. н. Соловьев В.Б.
Пенза 2009 г

Содержание


      Введение 3
      1. Переносчики: разнообразие функций 7
      2. Переносчики как ферменты: применение теории скоростей 9
      3. Применение теории переходного состояния при изучении работы переносчиков 10
      4. Анализ стационарного состояния 12
      5. Некоторые симпортеры, антипортеры и унипортеры 14
      5.1 Белок полосы 3 - анионный переносчик из мембраны эритроцитов 15
      5.2 Группа митохондриальных переносчиков. 17
      5.3 Переносчик глюкозы из мембраны эритроцита 18
      5.4 Лактозопермеаза из е. Соli 20
      6. Несколько примеров активных переносчиков, использующих энергию атр и фосфоенолпирувата 22
      6.1 Переносчики катионов плазматической мембраны (е1e2-типа): атр-зависимые ионные насосы 25
      6.2 АТР-азы F1F0-типа из митохондрий, хлоропластов и бактерии 30
      6.3 Три других класса переносчиков 32
      Заключение 36

Введение

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ.

Фосфолипидный биослой является очень эффективным барьером для множества небольших растворимых молекул. Тем не менее через плазматическую мембрану, а также через мембраны, ограничивающие различные органеллы (например, митохондрии), постоянно транспортируются полярные вещества и ионы. Этот транспорт целиком опосредован белками, и для объяснения механизма переноса растворимых веществ через мембрану было предложено много моделей. Будет полезно ввести несколько терминов, использующихся для характеристики белков или структур, участвующих в трансмембранном транспорте. В табл.1 дается классификация транспортных белков. Прежде всего их подразделяют на каналы (или поры) и переносчики. Поры и каналы часто изображают в виде туннелей через мембрану, в которых места связывания транспортируемых растворимых веществ доступны с обеих сторон мембраны одновременно. Канальные белки не претерпевают никаких конформационных изменений в процессе переноса растворимых веществ с одной стороны мембраны на другую. Напротив, конформация переносчиков в процессе транспорта различных веществ изменяется. Переносимое вещество связывается с одной стороны мембраны, и для высвобождения его с другой стороны в переносчике должно произойти определенное конформационное изменение. При этом в любой момент времени место связывания вещества доступно только с одной стороны мембраны.

Таблица 1. Классификация некоторых транспортных белков, основанная на механизме их действия и энергетике.

Переносчики можно разделить на две группы: пассивные и активные. Мы будем использовать термин пассивный переносчик в том случае, когда при его участии осуществляется перенос через мембрану единственного типа веществ. Переносчики-унипортеры только увеличивают поток вещества, идущий без потребления энергии, т.е. по градиенту электрохимического потенциала. Такой процесс называется облегченной диффузией. Наиболее полно изученным пассивным переносчиком является переносчик глюкозы в эритроцитах.

Активные переносчики осуществляют перенос веществ через мембрану с затратами энергии, в результате эти вещества накапливаются с одной стороны мембраны. При этом транспорт вещества должен быть сопряжен с другим, запасающим свободную энергию процессом. Почти все первичные активные переносчики являются ионными насосами, в которых перемещение иона прямо сопряжено с поставляющей энергию химической или фотохимической реакцией. Примером ионного насоса является бактериородопсин, который для переноса протонов через мембрану использует энергию фотонов видимого света. В большинстве случаев ионные насосы являются электрогенными: при работе первичного насоса осуществляется перемещение заряда, в результате чего происходит разделение электрических зарядов и на мембране создается напряжение.

Первичные активные переносчики генерируют напряжение и создают трансмембранные ионные градиенты. Вторичные активные переносчики используют такие градиенты в качестве движущей силы для транспорта растворимых веществ. Наиболее полно охарактеризованным примером такого рода является белок - переносчик лактозы (лактозопермеаза) из Escherichia colt. Этот переносчик использует протонный электрохимический градиент, генерируемый дыхательной электронтранспортной цепью, в качестве движущей силы для накопления лактозы в клетке. Это пример симпорта, когда через мембрану одновременно переносятся два разных вещества (например, протоны и лактоза). Антипортеры осуществляют транспорт веществ в противоположных направлениях. Так, например, белок полосы 3 эритроцитов осуществляет сопряженный транспорт Cl - и НСО3 - в противоположных направлениях через эритроцитарную мембрану.

Термины пермеаза, транслоказа и переносчик, являющиеся синонимами, их часто используют по отношению к транспортным белкам, отличным от первичных активных переносчиков. Обычно термин "пермеаза" применяют при описании бактериальных транспортных белков. Термин "переносчик", по-видимому, лучше использовать по отношению к ионофорам или сходным с ними структурам, которые связываются с ионами и переносят их через биослой в составе комплекса.

Некоторые группы переносчиков:

1. Митохондриальные переносчики:

переносчик ADP/ATP; - переносчик Н+ - фосфатаза;

разобщающий белок (переносчик Н+ /ОН -)

2. Переносчики сахаров:

переносчик глюкозы (клетки млекопитающих);

переносчик Н+-арабинозы (Е. coli);

переносчик Н+ - ксилозы (Е. coli);

3. АТРазы E1E2-типа, сопряженные с трансмембранным переносом ионов:

Н+ /К+-АТРаза (слизистая желудка млекопитающих);

Na+ /К+ - АТРаза (плазматическая мембрана);

Са2+-АТРаза (саркоплазматический ретикулум);

Н+ - АТРаза (плазматическая мембрана);

К+-АТРаза (S. faecalis).

1. Переносчики: разнообразие функций

Функции переносчиков весьма разнообразны; проиллюстрируем их на нескольких примерах.

Таблица 2. Сравнение скоростей транспорта для некоторых систем.

Система
Скорость транспорта, с-1
Н+-лактозопермеаза Е
30
Переносчик глюкозы(эритроциты)
300
Анионный переносчик белок полосы 3
100 000
Бактериородопсин
50
Nа+/К+-АТРаза
450
Цитохром с-оксидаза
1000
В табл.2 приведены значения числа оборотов для нескольких переносчиков. Для лактозопермеазы Е. coli максимальное число оборотов составляет всего лишь 30 с-1. Ее роль состоит в транспорте лактозы - углевода, который затем участвует в клеточном метаболизме.
Для ионных насосов, использующих для работы энергию гидролиза АТР или переноса электронов, характерны максимальные числа оборотов, что довольно типично для ферментов.
Однако не все переносчики работают столь медленно. Анионный переносчик белок полосы 3 из эритроцитарной мембраны играет важную физиологическую роль в усилении быстрого трансмембранного обмена С1 - на НСО3-. Одна из функций эритроцитов заключается в усилении транспорта СО2 от различных тканей к легким. В венозных капиллярах СО2 быстро диффундирует через эритроцитарную мембрану. В клетке под действием карбоангидразы СО2 превращается в Н2СО3, затем быстро устанавливается равновесие Н2СО3 - Н+ + НСО3 - , и анион бикарбоната переносится через мембрану в плазму крови белком полосы 3. В результате по мере того, как эритроцит проходит по капиллярам, концентрация НСО3 - в плазме увеличивается, причем этот процесс занимает меньше 1 с. Когда кровь достигает легких, начинается диффузия СО2 в атмосферу. При этом под действием карбоангидразы в эритроцитах происходит массовое превращение Н2СО3 в СО2 и Н2О. Этот процесс в свою очередь является движущей силой для переноса аниона бикарбоната внутрь эритроцита, где он быстро превращается в СО2 и Н2О.
Транспортная система должна функционировать очень быстро, но в отличие от ионных каналов в аксонах здесь нет нужды в электрогенных реакциях, которые только замедлили бы быстрый массовый транспорт. Но транспорт катиона, например Na+, вместе с НСО3 - был бы нежелателен, поскольку изменение концентрации соли в эритроците привело бы к осмотическому дисбалансу. Эта проблема решается с помощью антипортера, который в обмен на каждый транспортируемый ион НСО3 - переносит в обратном направлении анион Сl-. Такая челночная система работает очень быстро.

2. Переносчики как ферменты: применение теории скоростей

Кинетическую теорию переходного состояния Эйринга, используемую энзимологами, успешно применяют и в случае различных транспортных систем. В основе этого подхода лежит предположение о том, что система может находиться в нескольких дискретных состояниях, каждому из которых соответствует стандартное значение электрохимического потенциала. При этом взаимные переходы между двумя состояниями сопряжены с переходом системы через промежуточные стадии с более высокой свобод ной энергией, и константы скоростей переходов зависят от высоты соответствующих энергетических барьеров. Минимумы на кривых изменения свободной энергии (рис.1) соответствуют местам связывания транспортируемых веществ. Можно предположить, что переносчик имеет одно или несколько мест связывания переносимых веществ. При достаточно высоких концентрациях переносимого вещества все эти места оказываются занятыми и скорость переноса достигает своего максимального значения К mах, равного максимальной скорости работы фермента. Экспериментальные подтверждения этому получены для всех переносчиков.

Рис.1

3. Применение теории переходного состояния при изучении работы переносчиков

Рассмотрим простой переносчик с одним местом связывания, транспортирующий молекулы через мембрану. Рис.2 иллюстрирует основные свойства как первичного активного переносчика, так и пермеазы.

Рис.2

Рассмотрим четыре состояния белка-переносчика:

1) белок обращен внутрь/связан с субстратом;

2) обращен внутрь/не связан;

3) обращен наружу/ связан с субстратом;

4) обращен наружу/не связан.

Тогда транспорт можно представить в виде следующей последовательности элементарных обратимых стадий. Субстрат связывается с участком, обращенным к одной стороне мембраны (определяемой как цис-сторона). Происходит конформационное изменение, существенно уменьшающее кинетический барьер для перемещения иона к выходу из канала и увеличивающее энергетический барьер для движения в обратном направлении. Это конформационное изменение может быть спонтанным или может происходить с потреблением энергии (например, энергии гидролиза АТР). Участок переносчика со связанным субстратом оказывается теперь обращенным к противоположной стороне мембраны (определяемой как транс-сторона). Субстрат высвобождается из комплекса с переносчиком и выходит на противоположной стороне мембраны. Для активных переносчиков сродство субстрата к белку ниже, когда место связывания обращено к транс-стороне мембраны. Происходит конформационное изменение, возвращающее белок-переносчик к исходной конформации, в которой место связывания вновь обращено к цис-стороне.

Ключевым моментом в работе всех переносчиков является наличие высокого энергетического барьера, для преодоления которого соответствующие белки должны претерпеть конформационные изменения. Если для этого необходима энергия, то система может работать как активный переносчик (пример - Са2 + - насос, транспортирующий ионы Са2+ за счет энергии гидролиза АТР). Если для конформационного перехода необходимо, чтобы молекула переносимого вещества была связана с белком, т.е. стадия 4 отсутствует, то белок будет катализировать только обмен вещества через биослой, поскольку он не может изомеризоваться в "незагруженной" форме (пример - белок полосы 3 эритроцитов). Кинетическая теория переходного состояния имеет определенные ограничения, но ее применение упрощает решение многих сложных задач и позволяет единым образом подходить к рассмотрению различных транспортных механизмов.

4. Анализ стационарного состояния

Для кинетической характеристики транспортных систем, которые катализируют облегченную диффузию или активный транспорт, могут использоваться различные подходы к анализу стационарного состояния. Все эти подходы основаны на измерении скорости переноса растворимых веществ через мембрану, но при разных условиях. В качестве примера мы рассмотрим эксперименты, которые проводились на пермеазах и мембранных везикулах. Обычно для такого рода измерений используют радиоактивные метки. Ключевым моментом является то, что пермеаза должна не только переносить вещество через бислой (цис > транс), то также и возвращаться обратно (транс > цис). Скорость транспорта может зависеть от любой из этих стадий. Опишем вкратце некоторые подходы к анализу.

1. Субстрат присутствует только с одной стороны мембраны (цис). Начальная скорость транспорта измеряется для однонаправленного потока. Обратите внимание, что для обеспечения постоянного потока транспортируемого вещества переносчик (пермеаза) должен вернуться свободным. Измеряют поток как функцию [S] цис для процесса, протекающего в любом направлении (например, для переноса вещества внутрь везикул или для выведения его из везикул).

Равновесный обмен. Субстрат присутствует в одинаковой концентрации с обеих сторон мембраны, но радиоактивная метка - только с одной стороны (цис). В этом случае пермеаза может возвращаться, будучи связанной с немеченым веществом. Из меряют поток как функцию [S].

Меченый субстрат находится с цис-стороны мембраны, а в насыщающей концентрации он присутствует на противоположной (транс) стороне. Измеряют поток как функцию [S] цuc. Как и в первом случае, при этом регистрируют однонаправленный поток (цис> транс). Такой поток называют также встречным, поскольку меченое вещество переносится против своего химического градиента.

Удельная радиоактивность субстрата с обеих сторон мембраны одинакова. В насыщающей концентрации субстрат находится на транс-стороне, a [S] цис изменяется. В этом случае измеряют суммарный перенос, поскольку радиоактивное вещество пересекает мембрану в обоих направлениях. При таких условиях измерения состояние системы близко к равновесному.

Во всех случаях определяют Vmax и Км которые при этом не обязательно совпадают для разных подходов. Для разных моделей можно получить кинетические уравнения для стационарного состояния и проверить их. Как и в классических работах по энзимологии, очень полезным может оказаться использование ингибиторов. При этом ингибиторы можно вводить с любой стороны мембраны, что позволяет получить дополнительную информацию.

Такого рода подходы можно применять при работе с клетками, субклеточными мембранными везикулами или искусственными реконструированными системами. Для исследования работы ионных каналов обычно применяют электрические методы, которые дают огромные преимущества. Их мы рассмотрим в следующем разделе.

5. Некоторые симпортеры, антипортеры и унипортеры

К настоящему времени достаточно хорошо охарактеризовано несколько систем, катализирующих транспорт одного или более растворимых веществ. При этом скорость переноса с помощью этих белковых комплексов гораздо ниже, чем даже через наиболее "медленные" каналы. В данном разделе мы рассмотрим переносчик глюкозы и анионный переносчик (белок полосы 3) из мембраны эритроцита, лактозопермеазу из Е coli и группу митохондриальных переносчиков. Транспортные функции этих белков весьма разнообразны: они катализируют облегченную диффузию одного какого-то вещества, симпорт Н+ и сахара, в результате чего происходит накопление сахара в клетке, и антипорт растворенного вещества.

Отметим некоторые общие свойства этих процессов:

1. В некоторых случаях эти транспортные белки являются олигомерами, обычно димерами. Однако, по-видимому, только у митохондриальных переносчиков (например, у системы обмена ATP/ADP) канал образуется из структурных элементов разных мо номеров. Во всех других случаях, по всей вероятности, каждая субъединица функционирует независимо, даже если она является частью олигомера.

2. Весьма высокая степень гомологии транспортных белков указывает на их близкое структурное родство, хотя они существенно различаются как по субстратной специфичности, так и по функциям. Это позволяет предположить, что для широкой группы функционально различных переносчиков характерны общие транспортные механизмы.

3. Для анализа работы в большинстве случаев транспортных белков можно с успехом использовать модели с чередованием кон- формационных состояний, аналогичные модели, схематически представленной на рис.2. При этом лимитирующей стадией является конформационное изменение с той стороной мембраны, где находится место связывания.

4. В большинстве случаев сродство переносчика к транспортируемому веществу не зависит от того, к какой стороне мембраны обращено место связывания. Однако для первичных активных транспортных систем наблюдается иная картина.

5. Все рассматриваемые здесь переносчики обычно чувствительны к реагентам, действие которых направлено на сульфгидрильные группы. Однако это не обязательно должно означать, что между переносчиками имеется значительное структурное сходство или они используют одинаковый механизм транспорта. Например, установлено, что ни один из восьми остатков цистеина лактозопермеазы не участвует непосредственно в транспорте. Высказывалось также предположение, что погруженные в мембрану остатки пролина распределены в транспортных белках непропорционально, однако значение этого факта остается неясным.

5.1 Белок полосы 3 - анионный переносчик из мембраны эритроцитов

На долю белка полосы 3 приходится около 25% общего количества мембранных белков эритроцита человека; сходные белки присутствуют также в неэритроидных клетках. Этот белок выполняет несколько функций, причем их можно соотнести с двумя основными доменами белковой молекулы. N-концевая часть (41 000 Да) является гидрофильной и локализована с цитоплазматической стороны эритроцитарной мембраны. Она содержит места связывания для компонентов цитоскелета (анкирина), а также для ферментов гликолиза и гемоглобина. Этот домен можно удалить путем протеолиза, не затронув С-концевого домена (52 000 Да), который остается связанным с мембраной и опосредует Сl - /НСО3 - обмен, а также образует канал в мембране, через который может проникать вода. Внецитоплазматический компонент этой части белка содержит также углеводные антигенные детерминанты нескольких систем групп крови. В мембране белок полосы 3 находится в форме димера или тетрамера.

Было проведено клонирование и секвенирование участка ДНК, кодирующего белок полосы 3 из эритроцитов мыши. Эти данные послужили основой для построения модели белка полосы 3. Было высказано предположение, что он имеет 12 трансмембранных б-спиралей, при этом некоторые из них являются амфифильными. Экспериментальные данные, подтверждающие эту гипотезу, получены только для нескольких участков полипептида и основаны главным образом на результатах протеолиза и локализации связанных углеводов.

Обширные кинетические исследования согласуются с моделью с чередованием конформаций и одним местом связывания (см. рис.2). Однако скорость равновесного анионного обмена с помощью переносчика по меньшей мере в 104 раз превышает скорость транспорта как такового. Следовательно, незагруженный переносчик не претерпевает быстрых конформационных превращений, необходимых для того, чтобы анион мог связаться с мембраной. По данным ЯМР с использованием 35С1, у переносчика имеется единственное место связывания, и оно может быть обращено как внутрь, так и наружу. Результаты опытов с использованием ингибиторов транспорта тоже свидетельствуют о том, что в канале имеется единственное место связывания аниона, локализованное где-то в середине канала. При этом предполагается, что переход этого места связывания с одной стороны мембраны на другую блокируется неким "скользящим барьером", который перемещается вдоль канала в результате конформационных изменений. Лимитирующей стадией является конформационный переход нагруженного переносчика, но происходит он достаточно быстро, с частотой 105 с-1 при 37 °С. По-видимому, такая высокая скорость предотвращает значительные конформационные изменения в белке. Природа этого конформационного перехода и точная структура канала экспериментально не определены.

Конформационный переход загруженного переносчика, лимитирующий весь транспортный процесс, лишь в очень малой степени зависит от мембранного потенциала. Это согласуется с таким конформационным переходом, в результате которого через мембрану перемещается 0,1 связанного с белком заряда. Если этот переход сопряжен с перемещением анионного субстрата, то он должен сопровождаться переносом противоиона, например заряженной аминокислотной группы. В отличие от этого потенциалзависимое конформационное изменение, индуцирующее открывание натриевого канала, приводит к результирующему перемещению через мембрану шести связанных с белком зарядов.

5.2 Группа митохондриальных переносчиков.

Гомологичность некоторых транспортных белков внутренней митохондриальной мембраны свидетельствует об их близком родстве: по всей вероятности, они произошли от общего предка в результате дивергентной эволюции. Имеются по меньшей мере три представителя этой группы:

1) ADP/ATP-транслоказа;

2) переносчик фосфата;

3) разобщающий белок.

В структуре этих белков имеется много общего, и тем не менее они существенно различаются по субстратной специфичности. ADP/ATP-транслоказа катализирует транспорт ADP и АТР через бислой. При физиологических условиях АТР транспортируется из митохондрий, a ADP переносится в матрикс. Механизм этого процесса, по-видимому, аналогичен таковому для белка полосы 3, за исключением того, что АТР несет на один отрицательный заряд больше, чем ADP, и поэтому обмен зависит от трансмембранного электрического потенциала на митохондриальной мембране. Переносчик фосфата осуществляет одновременно и симпорт Н+, и, по-видимому, механизм его работы сходен с описанным ранее механизмом для Н+ - лактозопермеазы из Е. coli. Этот белок катализирует транспорт фосфата внутрь митохондрий. Благодаря симпорту Н+ процесс в целом является электронейтральным и не зависит от трансмембранного потенциала. Разобщающий белок был обнаружен в митохондриях из клеток бурого жира млекопитающих; его функция заключается в диссипации протонного электрохимического градиента, создаваемого при функционировании дыхательной цепи, в результате чего генерируется тепло. Разобщающий белок может также катализировать транспорт анионов, например С1 - , так что, может быть, на самом деле он катализирует транспорт ОН-, который невозможно экспериментально отличить от транспорта Н+. Этот переносчик связывается с нуклеотидами, которые ингибируют транспорт, и его работа может регулироваться жирными кислотами.

Все три переносчика, а возможно, еще и б-кетоглутарат/малат-транслоказа, имеют сходное строение; этот вывод был сделан на основе данных об их аминокислотной последовательности. Все они имеют мол. массу около 33000 Да и состоят из трех гомологичных доменов, каждый из которых содержит 100 аминокислот. По всей вероятности, эти три домена образовались в результате утроения единственного гена. Была построена модель, согласно которой каждый из гомологичных доменов дважды пересекает мембрану, а вся субъединица содержит шесть трансмембранных б-спиралей. С этой моделью согласуются данные по химической модификации. Отметим, что такая структура имеет много общего с Na+ - каналом, состоящим из четырех родственных гомологичных доменов. ADP/ATP-транслоказа является димером и, по-видимому, содержит единственный канал, по которому осуществляется транспорт. Такой вывод основывается на результатах исследований по связыванию ингибиторов с высоким сродством (например, карбоксиатрактилозида).

5.3 Переносчик глюкозы из мембраны эритроцита

Этот переносчик охарактеризован наиболее полно из всех белков, катализирующих диффузию единственного вещества через мембрану. Он переносит через эритроцитарную мембрану D-глюкозу, которая затем используется при гликолизе. Такие же или аналогичные переносчики глюкозы присутствуют и в других типах животных клеток. Большой прогресс в этой области исследований был достигнут благодаря секвенированию ДНК, кодирующей переносчик глюкозы из клеток гепатомы человека и из клеток мозга крысы. Очищенный переносчик из эритроцитов представляет собой гликопротеин с кажущейся мол. массой 55 000. По-видимому, в мембране он находится в виде димера. Если судить по данным об аминокислотной последовательности, то переносчик должен содержать 12 трансмембранных б-спиральных участков, однако экспериментальные данные не дают окончательного ответа на этот вопрос. Очищенный переносчик удалось встроить в фосфолипидные везикулы, при этом оказалось, что он ориентирован асимметрично.

Как и при исследовании канальных белков, очень важную роль сыграли опыты с использованием специфических ингибиторов, обладающих высоким сродством к переносчику. В число этих ингибиторов вхо и т.д.................


Перейти к полному тексту работы



Смотреть похожие работы


* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.